結核 菌サイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞濃縮

病原体による細胞外小胞(EV)放出は、感染症を制御するための新しい技術を解き放つ鍵となる可能性がある¹。 結核菌(Mtb)は、世界人口の約3分の1に感染し、毎年何百万人もの人々の命を奪っている、重大な結果をもたらす病原体です²。MtbによるEV生産は、感染の文脈におけるこれらのEVの生合成および様々な役割(すなわち、免疫刺激性、免疫抑制性、鉄および栄養素の獲得)において十分に文書化されているが、とらえどころがない^3,4,5。Mtb EVsの組成を理解するための努力は、免疫学的に重要な脂質およびタンパク質を含む原形質膜に由来する50〜150nmの脂質膜封入スフェアを明らかにした^3,6。細菌生理学におけるMtb EVの役割の調査により、生存のための環境ストレスに対する細菌EV調節の重要性が明らかになった⁵。宿主-病原体相互作用研究は解釈がより複雑であったが、Mtb EVが宿主の免疫応答に影響を与え、効果的なワクチン接種成分として潜在的に役立つ可能性があることを示す証拠^がある3,4,7。

これまでのところ、Mtb EVのほとんどの研究では、小胞濃縮のために密度勾配超遠心分離に依存してきました⁸。これは小規模な研究に効果的です。ただし、この手法にはいくつかの技術的および物流上の課題があります。代替ワークフローは、全細胞と大きな破片を除去するための多段階遠心分離と、EVをペレット化する最終的な超遠心分離ステップを組み合わせます。この方法論は、効率が異なり得、そしてしばしば、可溶性非小胞関連生体分子の低収率および共精製をもたらし、小胞の完全性にも影響を及ぼす⁹。さらに、このプロセスは時間がかかり、手作業に時間がかかり、機器の制約によりスループットが非常に制限されています。

本プロトコルは、密度勾配超遠心分離に代わる技術であるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)について記載する。この方法は環境マイコバクテリアについて実証されており、現在の研究ではMtb¹⁰に外挿されている。市販のカラムおよび自動分画コレクターは、小胞調製における一貫性を改善し、特定の高価な装置の必要性を低減することができます。密度勾配超遠心分離と比較して数分の一の時間でこのプロトコルを完了し、スループットを増加させることもできる。この技術は技術的に難しくなく、習得が容易になり、実験室間/実験室内の再現性を高めることができます。最後に、SECは分離効率が高く、穏やかで、小胞の完全性を維持します。