息肉救助是由急性应激引起的一个过程,其中珊瑚息肉消化将它们连接到殖民地的组织并从中分离出来作为个体生活。本方案描述了如何使用高盐碱或无钙海水处理来救助珊瑚微繁殖。
珊瑚是由称为息肉的模块化单元形成的殖民地动物。珊瑚虫在生理上通过组织连接和连接。息肉救助现象是由急性应激引起的一个过程,其中珊瑚虫消化连接它们与殖民地其余部分的组织,并最终从骨骼中分离出来,继续作为单独的个体生活。多年来,珊瑚生物学家已经承认息肉救助的过程,但直到最近,这一过程产生的微繁殖物才被公认为珊瑚生物学研究的典范系统。使用息肉救助可以从单个珊瑚碎片中产生大量的克隆单元。另一个好处是,单个息肉或息肉斑块可以在显微镜下轻松可视化,并在高度标准化的低成本环境中进行维护,例如培养皿,烧瓶和微流体芯片。本方案展示了能够诱导珊瑚微繁殖的可重复方法以及长期维持单个息肉存活的不同方法。这种方法能够在救助后长达8周内成功培育出疣状珊 瑚物种的 息肉,展示了使用单个珊瑚息肉进行珊瑚研究的实用性。
巩膜珊瑚或造礁珊瑚是能够形成碳酸盐骨架,形成珊瑚礁和结构复杂的生态系统的桔梗,可以从深水到浅水环境中找到1。热带珊瑚礁拥有高度的生物多样性,并提供基本的生态系统服务,如海岸保护和渔业维护2.大多数浅水造礁珊瑚依赖于与 共生藻科的藻类的互惠关系,共生藻类提供了珊瑚构建骨骼所需的能量。珊瑚和藻类之间的共生关系可以被环境压力破坏,导致珊瑚白化3,4,5,6。最近的温度异常导致世界各地的珊瑚白化事件,导致大规模珊瑚死亡和永久珊瑚礁退化7,8,9,10,11。由于这种现象是基于热应激后相关细胞机制(如细胞凋亡,自噬和胞吐作用)排出共生体,因此珊瑚白化可以被描述为具有生态系统规模后果5,6,12的细胞过程,这意味着珊瑚细胞或组织的 体外 培养将适用于密切研究这种现象。
由于珊瑚礁的重要性及其面临的主要威胁,特别是在过去二十年中2,珊瑚已成为全球保护和恢复目的的研究重点13.然而,开发可靠,可重复且对环境影响最小的方法和实验系统来研究珊瑚是该领域的主要斗争。
微繁殖被定义为通过在受控容器中培养其生物材料来体 外 增殖生物体的基因型14,15。近几十年来,细胞、组织和器官的培养对植物和动物生物学至关重要。它允许在实验室中大规模繁殖生物体,快速评估不同的治疗方法(如药物和药物),并直接研究细胞功能14,15,16,17。一般而言, 体外 模型对于在更好地控制的物理和化学条件下补充和深化不同生物体的研究是有用的。由于 体外 培养技术的优势,不同的动物细胞和组织培养技术已被开发,优化并用作许多研究领域的重要工具,其中多种细胞系已被研究和商业化用于众多应用16,17,18。
自1882年第一次动物组织培养以来,细胞和组织培养的知识已经取得了许多进步17, 例如使用天然和合成培养基, 已建立的细胞系的发明, 以及开发 3D 培养基以更好的方式培养多种细胞类型16,17,18,19.然而,细胞生物学领域主要集中在一组选定的模式生物上,而许多分类群仍然没有完善的细胞,组织或器官20的体外培养物。例如,在珊瑚研究中,没有永生化的细胞系被广泛用于研究,从而限制了珊瑚细胞研究使用原代细胞培养物。这些培养物的生存能力仅限于21周,没有研究记录所有珊瑚组织中单个细胞的存活时间超过13天,直到2021年初22。将要发表的第一份可持续珊瑚细胞系的报告是具有长达6个月的Acropora tenuis细胞,这些细胞对未来研究的效用仍有待探索23.
为了克服培养珊瑚细胞培养物的局限性并保持保留珊瑚整体组织组织的实验室培养,最近提出了使用分离的息肉作为珊瑚生物学研究的模型24,25。息肉是珊瑚的解剖学单位,它们中的每一个都有一个位于口腔圆盘中心的嘴,并通过其腹侧区域的coenosarc连接到其他息肉26。活息肉的分离通过息肉纾困过程自然发生,其中急性应激导致息肉之间腹肉的消化,然后可以从蜂群的骨骼中分离25,27,28。据报道,这种现象发生在多种分类群中,包括八角藻29,30,31,黑珊瑚32和巩刹纪珊瑚25,27,28,32,33,并且已经与多种环境压力源有关,例如水中缺钙24,34,酸度增加35,高渗条件25,27,32,36,高温36,37,饥饿33,空气暴露25,30和杀虫剂污染28,38。例如,息肉救助在斑秃珊瑚19中已有报道,这些珊瑚广泛分布在世界各地,通常用作珊瑚研究的模型。属于该组的物种,如达米角虫和西葫芦,从5毫米的25个碎片中产生了大约30-40个微繁殖体。这个数字强调了使用息肉救助作为珊瑚微繁殖方法的优势,因为它创造了从一小块珊瑚中产生许多遗传上相同的个体的可能性。使用分离的息肉进行研究也具有与细胞培养相同的优势,即在受控的实验室环境中培养的可能性,例如烧瓶和培养皿。此外,维持活息肉的微流体平台已经证明,这些微繁殖体可以保持在相对便宜且易于繁殖的环境中,水流,表面和温度受控24,25。这些微流体平台也可用于在显微镜下直接可视化活珊瑚结构24,25。
在本文中,我们总结并演示了已经开发的从其殖民地分离单个珊瑚虫的技术,展示了如何在实验室条件下维持它们以进行长期培养。所讨论的方法包括通过蒸发和泵送高盐度海水的高渗条件以及在无钙海水中孵育来拯救息肉。
息肉在提交救助过程后的存活率和完成该过程所需的时间在先前报告的研究25,33,41之间有所不同,这可能由每项研究中应用的不同实验方法来解释。例如,不同的珊瑚物种,甚至来自同一物种但适应不同环境条件的珊瑚(例如,来自红海的珊瑚),对盐度水平有不同的阈值。选择的救助方法和实验室/水族箱条件在结果中也起着重要作用。在某些情况下,在实验室条件下,珊瑚微繁殖体的维持已经超过了珊瑚细胞培养物的存活时间,在偶氮杂环海3,3,41和虫黄体25珊瑚中存活了数月。在不同的研究中,息肉救助过程完成的时间也有所不同,从几个小时25,27,30到孵化的第35周,暴露于导致救助的压力源。在研究息肉救助时要考虑的另一个变量是息肉在暴露于触发息肉释放的急性压力后恢复。救助后的息肉是否处于足够好的状态以用作研究珊瑚生物学的模型,这仍然是值得商榷的。在使用这些微繁殖体时,在粘链动物降解后恢复其组织是一个值得关注的问题。然而,在许多研究中,包括现在的息肉,已经能够在25,27,32,36之后的几周内在其组织和外部形态内呈现出具有完整口腔 – 鼻腔极化和触手的虫黄藻细胞。以前的研究还发现,在从急性应激中解脱出来后,暴露于高盐水或加热海水中的释放的珊瑚息肉已经能够将与细胞凋亡,蛋白水解和细胞分裂等过程相关的基因表达恢复到与救助32,36之前相似的水平,甚至增加与组织愈合相关的基因的表达36。
关于方法之间存活率的差异,重要的是要强调,即使使用相同的技术,这段时间也可能因不同的实验而异,并且可能与所用片段的健康状况以及救助过程后息肉的适当维护有关。在通过无钙海水孵育进行救助的情况下,息肉存活率限制为1天。因此,可以得出结论,该方法不太适合所研究物种的长期生存,或者必须更好地适应来自红海的疣状疱 疹 珊瑚的技术。报道的结果显示,当息肉滴落高盐度水时,基于盐度逐渐增加的方法获得了更长的存活时间。与蒸发法相比,这种方法可以提供更可控的盐度增加,同时不会导致海水中发现的其他物质的浓度增加,包括珊瑚的代谢废物,这对生物体具有潜在的毒性。由于所有这些原因,这种方法已被建议作为维持健康息肉27的更安全的替代方案。虽然这种方法被假设对息肉健康更安全,并且能够产生寿命更长的息肉,但这一事实在目前的出版物中得到了证实,但需要进一步的调查来证实这一点。两项高盐度诱导的救助实验都表明,在盐度在24 h内达到59 PSU后息肉完全脱离。如果盐度增加超过救助完成的水平,息肉将受到进一步的压力,从而降低它们生存和从急性应激治疗中恢复的机会。因此,不建议在这样的盐度水平下将息肉维持更长时间。当通过暴露于无钙海水来执行救助诱导方法时,在无钙人工海水中孵育3小时获得完全分离,这意味着也不建议进一步暴露于该培养基。
为了解决更适合在实验室/体外调查中 研究珊瑚息肉的方法,本研究仅关注三个程序,这些程序需要近24小时才能完成救助过程,并用于涉及长期维持巩膜珊瑚虫的研究。据报道,其他方法花费的时间比这段时间要长得多,但没有使用。本研究没有尝试将息肉沉降到基质上,该研究的重点是产生可以转移到不同环境或使用一次性移液器轻松收集以进行分析的息肉。结果表明,来自珊瑚属 的 息肉保持存活,具有相关的虫黄藻细胞,健康的视觉状态和保存的大体外部解剖结构长达8周,即使没有附着在基质上。这些结果表明,使用本研究演示的一些技术,可以从单个珊瑚碎片中产生更多的生物重复。这种生物重复可以保存在受控环境(如培养皿和细胞瓶)中,并在实验室条件下进行为期一个月的实验,并用于多种目的。
自从第一次偶然描述息肉救助42,43以来,已经建立了新的方案来寻找更标准化的方法来诱导息肉释放并保持这种息肉活着,这可用于未来的研究应用。其中包括调查与珊瑚全息体生理学44和宿主 – 微生物组相互作用45相关的不同方面,珊瑚白化5,25所涉及的分子机制,以及珊瑚全息体的健康,恢复力和保护12,13,46,47.此外,释放的珊瑚息肉可用于研究领域以外的应用,并且已被建议用于创建可以附着在基质上并生长的繁殖物,一旦标准化的救助协议变得普遍,可能会产生多个可用于恢复目的的珊瑚个体28.总体而言,尽管应该使用救助息肉进行更深入的实验以使该方法标准化,但已经表明息肉救助是一种可重复的方法,可以用作珊瑚研究的工具,用于多种目的。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢亚当·巴尔诺和弗朗西斯卡·加西亚对珊瑚虫实验和监测的支持。我们也感谢KAUST沿海和海洋资源核心实验室在水族馆维护和基础设施方面的帮助。该研究由KAUST拨款编号BAS / 1 / 1095-01-01资助。
5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
Percival Incubator – I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |