Análisis del volumen del territorio de astrocitos y mosaicos en secciones gruesas de tejido de flotación libre

Los astrocitos son células elaboradamente ramificadas que realizan muchas funciones importantes en el cerebro¹. En la corteza del ratón, las células madre gliales radiales dan lugar a astrocitos durante las etapas embrionaria tardía y postnatal temprana². Durante las tres primeras semanas postnatales, los astrocitos crecen en tamaño y complejidad, desarrollando miles de ramas finas que interactúan directamente con las sinapsis¹. Al mismo tiempo, los astrocitos interactúan con los astrocitos vecinos para establecer territorios discretos y no superpuestos para alicatar el cerebro³, mientras mantienen la comunicación a través de los canales de unión^{de brecha 4}. La morfología y la organización de los astrocitos se interrumpen en muchos estados de enfermedad después de un insulto o lesión⁵, lo que indica la importancia de estos procesos para la función cerebral adecuada. El análisis de las propiedades morfológicas de los astrocitos durante el desarrollo normal, el envejecimiento y la enfermedad puede proporcionar información valiosa sobre la biología y la fisiología de los astrocitos. Además, el análisis de la morfología de los astrocitos después de la manipulación genética es una herramienta valiosa para discernir los mecanismos celulares y moleculares que gobiernan el establecimiento y mantenimiento de la complejidad morfológica de los astrocitos.

El análisis de la morfología de los astrocitos en el cerebro del ratón se complica tanto por la complejidad de la ramificación de los astrocitos como por el mosaico de los astrocitos. La tinción de anticuerpos utilizando la proteína ácida fibrilar glial de filamento intermedio (GFAP) como marcador específico de astrocitos captura solo las ramas principales y subestima enormemente la complejidad morfológica de los astrocitos¹. Otros marcadores específicos de la célula, como el transportador de glutamato 1 (GLT-1; slc1a2), la glutamina sintetasa o la S100β, hacen un mejor trabajo al etiquetar las ramas de astrocitos⁶, pero introducen un nuevo problema. Los territorios de los astrocitos no se superponen en gran medida, pero existe un pequeño grado de superposición en los bordes periféricos. Debido a la complejidad de la ramificación, cuando los astrocitos vecinos se etiquetan del mismo color, es imposible distinguir dónde termina un astrocito y comienza el otro. El etiquetado disperso o en mosaico de astrocitos con proteínas fluorescentes endógenas resuelve ambos problemas: el marcador fluorescente llena la célula para capturar todas las ramas y permite obtener imágenes de astrocitos individuales que se pueden distinguir de sus vecinos. Se han utilizado varias estrategias diferentes para lograr un etiquetado fluorescente escaso de astrocitos, con o sin manipulación genética, incluida la inyección viral, la electroporación de plásmidos o las líneas de ratones transgénicos. Los detalles sobre la ejecución de estas estrategias se describen en estudios y protocolos publicados previamente ^{1,7,8,9,10,11,12,13}.

Este artículo describe un método para medir el volumen del territorio de astrocitos de cerebros de ratón con marcado fluorescente en una población escasa de astrocitos (Figura 1). Debido a que el diámetro promedio de un astrocito en la corteza del ratón es de aproximadamente 60 μm, se utilizan secciones de 100 μm de espesor para mejorar la eficiencia en la captura de astrocitos individuales en su totalidad. No se requiere inmunotinción, pero se recomienda para mejorar la señal fluorescente endógena para imágenes y análisis confocales. La inmunotinción también puede permitir una mejor detección de ramas finas de astrocitos y reducir el fotoblanqueo de proteínas endógenas durante la adquisición de imágenes. Para mejorar la penetración de anticuerpos en las secciones gruesas y para preservar el volumen de tejido de la sección a través de imágenes, se utilizan secciones de tejido que flotan libremente. El análisis del volumen del territorio de los astrocitos se realiza utilizando un software de análisis de imágenes disponible comercialmente. Además, este protocolo describe un método para el análisis de mosaicos de astrocitos en secciones de tejido con marcado en mosaico, donde los astrocitos vecinos expresan diferentes etiquetas fluorescentes. Este protocolo se ha utilizado con éxito en varios estudios recientes ^1,8,9 para caracterizar el crecimiento de astrocitos durante el desarrollo normal del cerebro, así como el impacto de la manipulación genética en el desarrollo de astrocitos.