הדמיה של נדידת נויטרופילים בעור העכבר כדי לחקור עיצוב מחדש של קרום תת-תאי בתנאים פיזיולוגיים

כל הניסויים והנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי המכון הלאומי לסרטן (המכונים הלאומיים לבריאות, בת’סדה, MD, ארה”ב) הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקולים LCMB-031 ו- LCMB-035) ועמדו בכל התקנות האתיות הרלוונטיות. עכברים זכרים ונקבות בגילאי 2 עד 6 חודשים שימשו לניסויים. עכברי mT/mG ועכברים מארחים מסוג פרא (WT) נמצאים ברקע FVB/NJ ואילו עכברי LyzM-Cre x mTmG נמצאים ברקע C57BL/6. 1. חומרים והכנת ריאגנטים וכלים מצפים צינורות, כלים ומחטים/מזרקים עם PBS + 1% BSA (ללא סידן ומגנזיום) למשך הלילה תחת תסיסה. נקו בקפידה משטחים וכלים/מכשירים שישמשו לעבודה עם בעלי חיים תוך שימוש באתנול 70% או על ידי אוטוקלאבינג.לטיהור נויטרופילים, הכינו את הדברים הבאים: 3 x 15 מ”ל צינורות, 1 x 60 מ”מ צלחת, 1 x 1.5 מ”ל צינור; HBSS המכיל 10 mM HEPES (pH 7.3); תמיסת ליזה של תאי דם אדומים (ACK); היסטופק 1077; והיסטופק 1119. לזריקות נויטרופילים, הכינו את הפריטים הבאים: 1 x מזרק בנפח נמוך (10 μL), 1 x 33 G מחט משופעת, איזופלורן ותמיסת הרדמה (קטמין, קסילזין ואצפרומזין ב-80 מ”ג·ק”ג-1, 2 מ”ג·ק”ג-1 ו-4 מ”ג·ק”ג-1, בהתאמה, בתמיסת מלח). 2. טיהור נויטרופילים מעכבר תורם יש להרדים את העכבר התורם בהתאם לתקנות המוסדיות המקומיות. אספו עצמות ארוכות מהחיה (עצם הירך, השוקה וההומרוס), תוך שימת לב לשמירה על שלמות העצם והימנעות מחיתוך ראשי העצמות במהלך האיסוף24. בצלחת מצופה BSA בקוטר 60 מ”מ, הסירו את השרירים ואת רקמת השומן. חתכו את ראשי העצמות כדי לקבל גישה למח העצם, ולאחר מכן שטפו והומוגניזציה של מח העצם באמצעות מזרק (מחט 27 גרם) מלא HBSS. סנן את התמיסה לתוך צינור מצופה BSA של 15 מ”ל באמצעות מסננת של 40 מיקרומטר וצנטריפוגה אותה במהירות של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה ב 1 מ”ל של ACK למשך 30 שניות כדי ליזה את תאי הדם האדומים, ולאחר מכן הוסיפו 9 מ”ל של HBSS כדי לעצור את הליזה. צנטריפוגה את התמיסה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב RT. הכינו שיפוע שלב צפיפות בצינור מצופה BSA של 15 מ”ל על ידי הצבה עדינה של 4 מ”ל של 1119 Histopaque בתחתית הצינור, ולאחר מכן שכבות עדינות של 4 מ”ל של 1077 Histopaque בחלק העליון. יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מערבוב בין שתי השכבות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב -2 מ”ל של HBSS. הניחו בעדינות את התמיסה על גבי שיפוע השלבים שהוכן למעלה. סחרור במהירות של 1,000 x גרם במשך 30 דקות ב-RT עם מהירות ההאצה וההאטה הנמוכה ביותר האפשרית (עדיף “ללא בלם”). מראש הצינור, שואפים בעדינות מחצית משכבת ההיסטופק 1077. אספו את המחצית הנותרת של שכבת 1077 Histopaque ואת החצי העליון של שכבת Histopaque 1119 לתוך צינור טרי מצופה BSA. תרחיף התאים העכור בין שתי שכבות הצפיפות מכיל בעיקר נויטרופילים. הוסיפו HBSS כדי להגיע לנפח סופי של 15 מ”ל וערבבו בעדינות על ידי היפוך הצינור. סובב ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב- RT. לאחר הצנטריפוגה, להשהות מחדש ולשטוף את גלולת התא עם 10 מ”ל של HBSS ולהסתובב ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על ההליך, ולאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 15 מ”ל של HBSS כדי לקבוע את מספר התאים באמצעות מונה תאים. לבסוף, סובבו והשעו מחדש תאים ב-1 מ”ל HBSS והעבירו לצינור מצופה BSA בנפח 1.5 מ”ל. לאחר הטיהור, יש לשמור את מתלה הנויטרופילים בצינור המצופה ב-BSA תחת תסיסה עדינה למשך 30 דקות על מסובב צינור ב-RT עד לתיוג ו/או הזרקה.הערה: טיהור מוצלח מניב 10-20 x 106 נויטרופילים לכל עכבר עם טוהר של 95%. טוהר מוערך באמצעות ציטומטריית זרימה, באמצעות סמני נויטרופילים שתוארו בעבר (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ ו- CD11b+)25,26.הערה: פרוטוקולים לטיהור נויטרופילים מדם היקפי אנושי ומח עצם עכבר זמינים בעבר24,27. 3. תיוג נויטרופילים הערה: כדי להמחיש את הנויטרופילים, הם טוהרו מעכברי LyzM-Cre mT/mG , שבהם תאים מיאלואידים מבטאים פפטיד ממוקד קרום המאוחה עם GFP. בנוסף, נויטרופילים מטוהרים מעכברי בר (WT) סומנו במבחנה. השלבים הבאים מתארים את ההליך המשמש לסימון נויטרופילים מטוהרים בצבע פלואורסצנטי ירוק מסחרי החדיר לתאים, וניתן להתאים אותם לכל בדיקה פלואורסצנטית תואמת MPM אחרת לפי בחירתם. הוסיפו את הצבע הפלואורסצנטי הירוק (הריכוז המומלץ על ידי היצרן; כאן, 1 מיקרומטר) לתרחיף הנויטרופילים (מטוהר מעכבר WT) בצינור מצופה BSA בנפח 1.5 מ”ל. יש לדגור במשך 30 דקות ב-RT תחת תסיסה עדינה במסובב צינורות. שטפו שלוש פעמים באמצעות HBSS, סחררו ב-400 x גרם במשך 5 דקות ב-RT, והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ”ל HBSS. שמור את מתלה הנויטרופילים בצינור מצופה BSA תחת תסיסה עדינה במסובב צינור ב- RT עד להליך ההזרקה.הערה: הזרקת נויטרופילים מסומנים המבוצעת מיד לאחר התיוג עדיפה מאוד. עם זאת, במידת הצורך, נויטרופילים מסומנים יכולים להישמר תחת תסיסה למשך 10-15 דקות נוספות לאחר התיוג מבלי לפגוע בשלמות תגובת הנויטרופילים in vivo. תסיסה ארוכת טווח (יותר מ -60 דקות לאחר התיוג) תוביל לגושים, מוות נויטרופילים ותצפיות מטעות in vivo. ממש לפני ההזרקה, להשהות מחדש את גלולת התא בתמיסת מלח כדי להגיע לצפיפות של 2-5 x 106 תאים לכל 20 μL. 4. הזרקת נויטרופילים הערה: ההרדמה חייבת להתבצע בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הניחו את בעל החיים בתא סגור ותנו איזופלורן 3%-5% (קצב זרימה של 2 ליטר/דקה) באמצעות וופורייזר מכויל המחובר לרכז חמצן. הערך אם בעל החיים מחוסר הכרה על ידי בדיקת רפלקס נסיגה של כפות הרגליים בעת צביטת כרית כף הרגל האחורית. לאחר מכן, העבירו את בעל החיים למשטח חימום (37 מעלות צלזיוס) כדי לשמור על טמפרטורת גופו. המשך מתן האיזופלורן (1%-2%; ספיקה של 0.5 ליטר/דקה) דרך חרוט האף.הערת בטיחות: כדי להגביל את חשיפת הצוות לאיזופלורן רעיל, מומלץ להשתמש במערכת מתקן המצוידת ביחידת סינון כדי ללכוד מחדש איזופלורן במחזור. כדי לייעל את איכות ההדמיה, הסירו את השערות מהאוזן באמצעות גוזם עדין. הליך זה יכול להתבצע גם יום או יומיים לפני הניסוי.הערה: השימוש בקרם להסרת שיער אינו מומלץ מכיוון שהוא ידוע כמחמיר תגובה דלקתית בעור העכבר ומציג ממצאי הדמיה. הניחו את בעל החיים על צדו. בעזרת סרט ניתוח, החזיקו את קצה האוזן ושטחו אותה לאורך כרית החימום. החל בעדינות את הסרט כדי למנוע נזק לאוזן. מלא מזרק מצויד מחט 33 G עם השעיה נויטרופילים (2-5 x 10,6 תאים לכל 20 μL) ולהרכיב אותו על micromanipulator.הערה: זווית ההזרקה בין המחט לאוזן בכרית חימום חייבת להיות בין 10° ל-30° כדי למזער את הנזק לרקמות ולהגביר את הצלחת הזרקת התא. הזיזו בעדינות את המחט (עם השיפוע כלפי מעלה) לכיוון האוזן, וניקבו לאט את העור. ברגע שהמחט נמצאת בתוך העור, דחפו לאט את הבוכנה וספקו 2-3 מיקרוליטר של תרחיף תאים.הערה: יש להימנע מאזורים עם כלי דם גלויים, שכן פגיעה בכלי דם גורמת לתגובה חיסונית לא רצויה ומורכבת להזרקה ולבעיות בהדמיה. חזור על ההזרקה ב 2-3 אזורים שונים של האוזן, רצוי 2-3 מ”מ זה מזה. אין “למלא יתר על המידה” את האוזן בהשעיית התא.הערה: יש לבצע את ההזרקה במרכז האוזן. הפריפריה של האוזן דקה ויש לטפל בה בזהירות מכיוון שהיא עלולה להיפגע בקלות, בעוד החלק המרכזי עבה יותר המכיל כלי דם גדולים יותר ופחות זקיקי שיער, ויכול לעמוד בנפחי הזרקה גדולים יותר. הסר בזהירות את סרט הניתוח ותן לבעל החיים לחזור להכרה תחת פיקוח. אפשר לבעל החיים לנוח במשך שעה אחת לפני ההדמיה כדי לאפשר לרקמה ולתאים להתאושש מהליך ההזרקה. 5. הרדמה ל- IVM הערה: הרדמה עמוקה יותר משפרת באופן משמעותי את איכות ההדמיה על ידי הפחתת ממצאי התנועה עקב דופק ונשימה. עכברים המוזרקים על ידי נויטרופילים נתונים להרדמה כימית, המספקת הרגעה עמוקה יותר מאשר הרדמה הנגרמת על ידי גז. ההרדמה חייבת להתבצע בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. שעה לאחר ההחלמה מהזרקת נויטרופילים, מרדימים את בעלי החיים על ידי זריקה תת עורית המכילה תערובת של קסילזין/קטמין/אצפרומזין (80 מ”ג·ק”ג-1, 2 מ”ג·ק”ג-1 ו-4 מ”ג·ק”ג-1, בהתאמה) בתמיסת מלח.הערה: כדי להבטיח שחזור ואמינות של התוצאות, יש לשמור על חום בעלי החיים מרגע ההרדמה ועד סוף הניסוי באמצעות כרית חימום או כרית זרימת מים המחוברת למשאבת חימום. כדי לשמור על הרדמה מעבר לשעה, יש להזריק תערובת של קטמין/אצפרומזין (40 מ”ג·ק”ג-1, ו-2 מ”ג·ק”ג-1 בהתאמה) תת עורית כל 40 דקות. עקוב אחר עכברים מורדמים מעת לעת עבור סימני הכרה על ידי בדיקת רפלקס נסיגה כפות. בנוסף, עבור הליכי הדמיה הנמשכים יותר משעה אחת, יש למרוח משחה אופתלמית סטרילית ללא תרופות על העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית במהלך ההרדמה ולשמור על לחות הגוף על ידי הזרקות תת עוריות של תמיסת מלח (200 מיקרוליטר בכל שעה).הערה: לחילופין, ניתן להשתמש במערכת מבוססת זילוח מבוקרת דיגיטלית כדי להבטיח הזרקה תקופתית וחלקה של תמיסת ההרדמה ו / או לספק נוזלים. ניתן להגדיר התקן מזרק אוטומטי כדי לספק את נפח ההרדמה הרצוי ולספק הידרציה לפרקי זמן ארוכים יותר. לשם כך, מחט עירוי מכונפת ניתן להחדיר תת עורית לתוך העור הגבי של החיה מאובטח עם סרט כירורגי. 6. הדמיה הערה: מערך בעלי החיים ופרמטרי ההדמיה המתוארים כאן מותאמים למיקרוסקופ מולטיפוטון הפוך המצויד בקו לייזר יחיד כדי לעורר ולאסוף בו זמנית פליטות מהפלואורופורים השונים. לפני הנחת בעל החיים המרדים על שלב המיקרוסקופ, ודא כי המיקרוסקופ מופעל וכי הן השלב והן העדשות מחוממים מראש ל 37 מעלות צלזיוס. כסו את החור על הבמה עם כיסוי זכוכית (עובי #1 או 1.5) המיושר עם העדשה המחוממת. העבר את החיה אל הבמה בזהירות. אם ההדמיה מתוכננת למשך זמן ארוך (>1 שעות), יש למרוח משחת עיניים ולאבטח את מערכת הזילוח המבוססת על עירוי מכונף כמתואר לעיל. הניחו טיפת מלח על מרכז הכיסוי והניחו מעליה את האוזן המוזרקת לנויטרופילים. שטחו בעדינות את האוזן באמצעות צמר גפן סטרילי לאורך מרכז הכיסוי כדי להסיר כיסי אוויר.הערה: מריחת מי מלח (או PBS) בין האוזן לכיסוי מפחיתה את שבירת האור עקב כיסי האוויר, ובכך מבטיחה מדד שבירה אחיד ואיכות הדמיה מעולה. אבטחו את האוזן על-ידי לחיצה עדינה על מקל עץ (שהוסר ממקלון הצמר גפן) לצד האוזן קרוב יותר לראש החיה ונעילתו באמצעות סרט הדבקה (איור 1A).הערה: מקל עץ מאובטח ממזער את התנועה עקב פעימות הלב והנשימה ומגביר באופן דרמטי את איכות ההדמיה. חשוב לציין, מקל העץ חייב להיות מהודק בדיוק מספיק כדי לייצב את האוזן מבלי לפגוע בזרימת הדם. באמצעות עינית המיקרוסקופ, למצוא אזור עניין, ולאחר מכן לעבור למצב רכישת multiphoton. הגדר את אורך גל עירור הלייזר ל- 900-930 ננומטר כדי לאפשר רכישה בו זמנית של צבע פלואורסצנטי GFP/ירוק, mTomato וכן קולגן-I (באמצעות SHG). הגדר סט מתאים של מראות ושילוב מסננים על הגלאים כדי לאסוף את האור הנפלט (מסנני פסים: כחול = 410-460 ננומטר, ירוק = 495-540 ננומטר, אדום = 580-640 ננומטר).הערה: נויטרופילים מוזרקים, כאשר הם מסומנים בצבע ירוק-פלואורסצנטי, מציגים פלואורסצנטיות ירוקה חזקה הגורמת להם להיראות מתחת לעינית המיקרוסקופ גם אם הם מוזרקים לחלקים עמוקים יותר של האוזן. קבע את ההגדרה המתאימה ביותר לתצורת החומרה. גם אם ניתן לעקוב אחר תאים נודדים במרווח של 30 שניות עד דקה אחת, תמונה של אירועים תת-תאיים במהירות גבוהה יותר (מרווח של <10 שניות לפחות). בדוגמה שלהלן, שני מערכי הדמיה שונים מוצגים כדי להראות את ההבדל בין IVM קלאסי ו- ISMic.בגישת IVM הקלאסית כדי לעקוב אחר נדידת תאים ולחקור את רקמת העכבר המארח (איור 1), השתמשו בעדשת 30x ובסורק גלבו עם גודל תמונה של 512 x 512 פיקסלים (גודל פיקסל של 0.83 מיקרומטר), וקבעו תזוזה של ציר z באמצעות השלב הממונע עם גודל צעד של 2 מיקרומטר, המאפשר הדמיה של נפח עומק של 30 מיקרומטר כל 30 שניות. בגישה ISMic לעיצוב מחדש של ממברנות דינמיות ביותר בהגדלה וברזולוציה גבוהות יותר (איור 2), השתמש בעדשת 40x ובסורק תהודה עם ממוצע של פי 3 וגודל תמונה של 512 x 512 פיקסלים (גודל פיקסל של 0.25 מיקרומטר), והגדר תזוזה של ציר z באמצעות piezo עם גודל צעד של 1 מיקרומטר, המאפשר הדמיה בנפח של 20 מיקרומטר כל 4-5 שניות. לעורר נדידת נויטרופילים על ידי גרימת פגיעת לייזר סטרילית. מקד את לייזר העירור בעוצמה גבוהה מספיק כדי להגיע לפחות 80 mW22, על שטח צר של הרקמה (20 מיקרומטר x 20 מיקרומטר) במשך 10 שניות. זהו את הפגיעה הנגרמת על-ידי הלייזר על-ידי האותות הפלואורסצנטיים האוטומטיים החזקים המופיעים בכל התעלות ועל-ידי השינוי בסידור הקולגן כתוצאה מכך (איור 1D).הערה: כדי להשיג תוצאות אמינות, הפציעה חייבת תמיד להיגרם רחוק ככל האפשר מכלי הדם; אם הם נקרעים, תאי הדם המשתחררים לרקמה ישפיעו על איכות ההדמיה וכן יגרמו לתגובה חיסונית כללית חזקה. שמור את הנתונים בסוף הניסוי לניתוחים נוספים. יש להרדים את בעל החיים בהתאם להנחיות המוסדיות המקומיות. במידת הצורך, ניתן לאסוף רקמות לצורך קיבוע ועיבוד נוסף. 7. ניתוח נתונים מייצג הערה: ניתן להציג ולנתח נתונים באופן חזותי באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, תוכנת צד שלישי או תוכניות מותאמות אישית. ההליך והכלים בהם נעשה שימוש תלויים בצרכים הספציפיים של החוקרים. מוצגת כאן דוגמה אחת לתהליך עבודה לכימות עקמומיות הממברנה ושינויי שטח מקומיים בקצה המוביל והאחורי של הנויטרופילים הנודדים. פתח את קבצי ההדמיה עם אימריס או פיג’י כדי לדמיין את נדידת הנויטרופילים ב- 4D ולקבוע את איכות הניסוי.הערה: אימריס ופיג’י יכולות לקרוא את פורמט ההדמיה של מספר מותגי מיקרוסקופ. עבד את הנתונים באמצעות השלבים הבאים על-ידי הפעלת סקריפטים מותאמים אישית של קוד MATLAB. קראו את קובצי ההדמיה שנבחרו עם חבילת Bio-Formats28 עבור MATLAB. פלח כל מסגרת של נפח 3D עם אלגוריתם Otsu29 כדי לזהות את התאים הבודדים. עקוב אחר האובייקטים המזוהים בהתבסס על קריטריון התזוזה המינימלי30. קבעו את קווי המתאר והגבולות הפעילים של העצם.צור הקרנה מרבית לכל אובייקט שזוהה במסגרת זמן. החילו את הפונקציה bwborders ב- MATLAB על ההקרנה המרבית של כל אובייקט מזוהה משלב 7.2 ליצירת 100 נקודות גבול. מטבו את נקודות הגבול המזוהות עם אלגוריתם קווי המתאר הדינמיים כדי להשיג דיוק תת-פיקסל31 (איור 3A) באמצעות הפונקציות בחבילת MATLAB שהורדו דרך http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/. שכבו-על את גבולות האובייקט ואת אינדקס מסלול האובייקט שנקבע על-ידי המעקב בשלב 7.3 עם ההקרנה המרבית של התמונה המקורית כדי להפיק פלט של סרט דו-ממדי עם שכבת-על לצורך תצוגה חזותית ובדיקה ידנית. בסרט השכבת-על, בחרו ידנית בכל העצמים המזוהים כתאים נודדים באמצעות אי-הכללת עצמים שאינם תאים, נגיעה בעצמים ועצמים עם גבולות לא מלאים. רשום את מדדי המעקב, מסגרות ההתחלה והסיום של כל מסלולי תא בגיליון אלקטרוני שישמש כקלט עבור השלבים הבאים המיושמים על ידי סקריפטים של קוד MATLAB. עקוב אחר נקודות הגבול של התא מכל מסגרת למסגרת הבאה בהתאם לקריטריון התזוזה המינימלי. השתמשו בפונקציה Polyarea ב- MATLAB כדי לחשב את השטח המסומן בקו תחתון על-ידי נקודות גבול סמוכות בשתי מסגרות זמן רצופות (איור 3C). אם גבול התא המקומי זז החוצה מהתא, הקצה סימן חיובי לשינוי האזור. אם גבול התא המקומי נע פנימה לתא, הקצה סימן שלילי לשינוי האזור. מדדו את עקמומיות הממברנה המקומית בכל נקודת גבול עבור כל מסגרת על-ידי התאמת נקודות הגבול השכנות למעגל (5 לכל צד; סה”כ 11)32 (איור 3B). צרו קימוגרפים באמצעות פונקציית התמונות ב-MATLAB (איורים 3D,E) כדי להראות את השינויים בתכונות התת-תאיות לאורך זמן ולהתייחס למיקום התא.