본 프로토콜은 복부 이뇌팔론(Dn)에서 신경독성 6-히드록시도파민(6-OHDA)을 갖는 성인 제브라피쉬의 뇌심실(ICV) 주사 및 개방 탱크 테스트를 사용하여 수영 거동 후 후유증의 장애 및 후속 회복에 대한 평가를 설명하며, 이는 비디오 추적 소프트웨어를 이용한 분석을 수반한다.
파킨슨 병 (PD)에서 도파민성 뉴런 손실을 지연시키는 현재의 치료법의 한계는 이러한 뉴런을 복원 할 수있는 대체 요법의 필요성을 제기합니다. 많은 노력은 현재 전임상 생체 내 모델을 사용하여 신경 재생에 대한 더 나은 이해를 지향하고 있습니다. 그러나 자기 복구를위한 이러한 재생 능력은 포유류에서는 비효율적입니다. 따라서 제브라피쉬와 같은 비포유류 동물은 지속적으로 자기 갱신하고 인간과 가까운 뇌 상동성을 가질 수있는 능력으로 인해 우수한 신경 재생 모델로 부상했습니다. 생체 내에서 신경 재생에 관여하는 세포 사건을 밝히기 위한 노력의 일환으로, 우리는 6-하이드록시도파민(6-OHDA)-유도성인 제브라피쉬 기반 PD 모델을 확립하였다. 이는 제브라피쉬 뇌의 복부 디뇌팔론(Dn)에서 도파민성 뉴런(DpN)을 특이적으로 제거하기 위해 99.96 mM 6-OHDA의 최적화된 뇌심실(ICV) 미세주입을 통해 달성되었다. 면역형광은 병변 후 3일째에 DpN 절제의 85% 이상을 나타내었고, 병변 후 30일 후 병변 부위에서 DpN의 완전한 회복을 나타내었다. 본 연구는 이동 거리 (cm)와 평균 속도 (cm / s)의 두 가지 매개 변수가 정량화 된 개방 필드 테스트를 사용하여 병변 후 제브라 피쉬 수영 행동의 손상과 후속 회복을 결정했습니다. 이동은 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 각 그룹의 개별 물고기 기록 (n = 6)을 분석하여 평가되었습니다. 연구 결과는 sham과 비교했을 때 병변 제브라 피쉬의 속도 (cm / s) 및 이동 거리 (cm)의 유의 감소 (p < 0.0001)를 보여주었습니다. 병변 된 제브라 피쉬는 30 일 후 수영 행동의 완전한 회복을 나타냈다. 본 연구 결과는 6-OHDA 병변 성인 제브라피쉬가 PD의 신경 재생 연구를 용이하게하는 재현 가능한 품질을 갖춘 우수한 모델임을 시사합니다. 신경 재생의 기초가되는 메커니즘뿐만 아니라 과정을 조절하는 내재적 및 외인성 요인에 대한 향후 연구는 PD에 대한 새로운 세포 대체 치료 전략에 대한 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
파킨슨 병 (PD)은 근육 경직, 휴식 떨림 및 서맥을 특징으로하는 질병으로 세계에서 가장 빠르게 성장하는 신경 질환입니다1,2. PD의 위험과 유병률은 특히 50 세 이상의 개인에서 나이가 들수록 빠르게 증가합니다3. PD의 병인과 병인은 지금까지 잘 이해되지 않고 있다. 이것은 종종 PD의 조기 발병을 진단되지 않은 채로 남겨 두었습니다. 현재, PD 환자에서 도파민의 부족과 도파민성 뉴런 (DpN)의 손실은 운동 증상의 징후와 강하게 관련이있다4. 이 관계를 활용하여, 도파민 대체 (즉, 레보도파)로 직접 작용하거나 DpN의 손실 (즉, 심부 뇌 자극)을 보상하기 위해 여러 가지 치료법이 설계되었습니다. 이러한 치료법은 증상 적 이점을 가져 오지만 질병의 악화 과정을 수정하지는 않습니다5. 이러한 중요한 약점을 고려하여 세포 대체 요법이 제안되었습니다. 그러나 이러한 접근법의 효능은 이식편 제제, 세포 성장 조절 및 표현형 불안정성의 도전을 고려할 때 일관성이 없다. 윤리적 문제를 제기했던 세포 대체 요법은 또한 뇌종양과 원치 않는 면역 반응을 유발할 위험을 제기한다6,7.
현재의 치료 전략의 한계는 PD 치료의 잠재적 인 접근법으로서 DpN의 재생에 더 중점을 두게했다. DpN의 재생 또는 신경 재생은 PD의 관리에서 유망한 돌파구 중 하나로 부상했으며, 이는 새로운 치료 방법으로서의 잠재력뿐만 아니라 질병의 메커니즘을 이해하는 수단으로 인해8, 9. 이 접근법은 기존의 전구 세포를 병변 회로로 분화, 이동 및 통합을 통해 신경 기능의 회복에 중점을 둡니다10. 신경 재생을 더 탐구하기 위해 다양한 생체 내 연구가 수행되었습니다. 포유류, 양서류 및 파충류와 같은 척추 동물이 손상 후 새로운 뇌 세포를 생성하는 것으로 나타났습니다11,12. 척추 동물 중에서 포유류 동물은 인간과 유전 적으로 닮았을 때 더 많이 추구됩니다. 그러나 포유류는 뇌 병변 후 성인기까지 지속될 수 있는 중추신경계(CNS)에서 제한적이고 열악한 회복 능력을 나타낸다13. 일반적으로, 포유동물은 낮은 수의 뉴런 생성이 PD에서 관찰된 손상된 신경 회로를 복원하기에 충분하지 않을 것이라는 점을 감안할 때 신경재생을 이해하기 위한 동물 모델로서 부적합하다. 따라서, 텔레오스트 기반 모델, 특히 제브라피쉬에서는 높은 증식 속도, 지속적으로 자기 갱신 능력, 인간과의 뇌 상동성을 닫는 능력 때문에 크게 선호된다14,15.
제브라피쉬는 PD16에서 무질서한 움직임을 연구하는 데 가장 일반적으로 사용됩니다. 제브라피쉬-기반 PD 모델은 일반적으로 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 및 6-하이드록시도파민(6-OHDA)17을 포함하는 신경독소에 의해 유도된다. DpN의 특이적 손실 및 도파민 수준의 감소를 유도하는데 효과적이지만, MPTP 기반 모델은 DpN 손실이 CNS18에만 국한되지 않기 때문에 PD의 조건을 밀접하게 모방하지 않는다. 6-OHDA가 혈액-뇌 장벽을 넘을 수 없기 때문에 근육내와 반대로 두개내로 투여될 때 뇌 내의 세포 및 기능 변화에 미치는 영향이 제한되었다19. 6-OHDA의 말초 투여는 신경계 전반에 걸쳐 도파민 수준의 세계적인 감소를 일으켰다20. 뇌척수액에 6-OHDA를 투여하는 동안 CNS21 전체에 걸쳐 DpN의 절제가 발생했으며, 이는 PD에서 볼 수 있는 바와 같은 상태를 모방하지 못함으로써 DpN의 손실이 인간 뇌의 흑질에서 특이적으로 발생한다. 반대로 6-OHDA의 ICV 투여는 특히 제브라피쉬 뇌의 복부 Dn 영역에서 DpN의 현저한 절제를 유도했으며, 이는 실질적 nigra22와 매우 유사했다. 흥미롭게도, DpN의 회복은 6-OHDA-유도된 병변 후 30일 후에 보고되었고, 이들 뉴런은 수명 동안 생존하였다23,24. DpN의 기능적 회복은 6-OHDA 유도 성인 제브라피쉬 기반 PD 모델(22)을 사용하여 이동 거리(cm) 및 평균 속도(cm/s)의 운동 평가를 통해 입증되었습니다.
본 연구는 확립 된 6-OHDA 유도 성인 제브라 피쉬 기반 PD 모델의 운동 평가를 성공적으로 시연했습니다. 전체 실험에는 ICV 미세 주사 전 준비, 제브라 피쉬의 ICV 미세 주사 및 운동 평가의 세 가지 주요 단계가 포함되었습니다. ICV 미세 주사 절차와 좋은 실험 결과에 따라 성인 제브라 피쉬의 건강한 회복을 보장하기 위해 본 연구에서 각 단계에 대한 몇 가지 좋은 관행이 권장되었습니다.
<p class="j…The authors have nothing to disclose.
이 작업은 말레이시아 고등 교육부가 기본 연구 보조금 제도 [600-IRMI / FRGS 5/3 (033/2019)]에 따라 지원했습니다.
Materials | |||
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
Ascorbic acid | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
Disposable pasteur pipette, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
Microcentrifuge tube, 0.2 mL | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30124332 | |
Nice conical flask, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
Equipment | |||
ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA | – | version 7.0; video tracking software |
Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Göttingen, Germany | SE 2 | |
FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000035 | |
Femtotip II, sterile injection capillary | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242957000 | |
InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000027 | |
LED Portable Lamp | MR. DIY, Selangor, Malaysia | 9023251 | 20 mAh |
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
Shanda aquarium heater | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
Thermometer | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
Video camera | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |