Het huidige protocol beschrijft de intracerebroventriculaire (ICV) injectie van volwassen zebravissen met neurotoxische 6-hydroxydopamine (6-OHDA) bij het ventrale diencephalon (Dn) en de beoordeling van de aantasting en het daaropvolgende herstel van zwemgedrag postlesion met behulp van de open tank test, die vergezeld gaat van analyse met behulp van een video tracking software.
De beperkingen van de huidige behandelingen in het vertragen van dopaminerge neuronale verliezen bij de ziekte van Parkinson (PD) verhogen de behoefte aan alternatieve therapieën die deze neuronen kunnen herstellen. Veel inspanningen worden momenteel gericht op een beter begrip van neuroregeneratie met behulp van preklinische in vivo modellen. Dit regeneratieve vermogen tot zelfherstel is echter inefficiënt bij zoogdieren. Niet-zoogdierdieren zoals zebravissen zijn dus naar voren gekomen als een uitstekend neuroregeneratief model vanwege zijn vermogen om zichzelf voortdurend te vernieuwen en een nauwe hersen homologie aan de mens te hebben. Als onderdeel van de inspanning om cellulaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij neuroregeneratie in vivo op te helderen, hebben we het 6-hydroxydopamine (6-OHDA) -geïnduceerde pd-model voor volwassenen op basis van zebravissen vastgesteld. Dit werd bereikt door de geoptimaliseerde intracerebroventriculaire (ICV) micro-injectie van 99,96 mM 6-OHDA om specifiek dopaminerge neuronen (DpN) in het ventrale diencephalon (Dn) van zebravishersenen te aborteren. Immunofluorescentie duidde op meer dan 85% van de DpN-ablatie op dag drie postlesie en volledig herstel van DpN op de laesieplaats 30 dagen postlesie. De huidige studie bepaalde de aantasting en het daaropvolgende herstel van het zwemgedrag van zebravissen na laesie met behulp van de open veldtest waarmee twee parameters, afgelegde afstand (cm) en gemiddelde snelheid (cm / s), werden gekwantificeerd. De voortbeweging werd beoordeeld door de opnames van individuele vissen van elke groep (n = 6) te analyseren met behulp van videotrackingsoftware. De bevindingen toonden een significante (p < 0,0001) vermindering van de snelheid (cm / s) en afgelegde afstand (cm) van laesie zebravissen 3 dagen postlesie in vergelijking met sham. De laesie zebravis vertoonde volledig herstel van zwemgedrag 30 dagen na de operatie. De huidige bevindingen suggereren dat 6-OHDA laesievolle volwassen zebravissen een uitstekend model is met reproduceerbare kwaliteit om de studie van neuroregeneratie bij PD te vergemakkelijken. Toekomstige studies naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan neuroregeneratie en intrinsieke en extrinsieke factoren die het proces moduleren, kunnen belangrijk inzicht bieden in nieuwe celvervangingsbehandelingsstrategieën tegen PD.
De ziekte van Parkinson (PD), een ziekte die kenmerkend wordt voor spierstijfheid, rusttremor en bradykinesie, is de snelst groeiende neurologische ziekte ter wereld1,2. Het risico en de prevalentie van PD nemen snel toe met de leeftijd, vooral bij personen van 50 jaar en ouder3 jaar. De etiologie en pathogenese van PD blijven tot nu toe slecht begrepen. Dit heeft het vroege begin van PD vaak niet gediagnosticeerd. Op dit moment zijn het gebrek aan dopamine en het verlies van dopaminerge neuronen (DpN) bij PD-patiënten sterk gekoppeld aan de manifestatie van motorische symptomen4. Profiterend van deze relatie, zijn verschillende behandelingen ontworpen om direct te fungeren als dopaminevervanging (d.w.z. levodopa) of om het verlies van DpN te compenseren (d.w.z. diepe hersenstimulatie). Hoewel deze behandelingen symptomatische voordelen opleveren, veranderen ze het verslechterende verloop van de ziekte niet5. Gezien deze aanzienlijke zwakte is celvervangingstherapie voorgesteld. De effectiviteit van deze aanpak is echter inconsistent gezien de uitdagingen van transplantaatpreparatie, celgroeicontrole en fenotype-instabiliteit. Celvervangingstherapie, die ethische bezwaren had opgeroepen, brengt ook het risico met zich mee van het induceren van hersentumoren en ongewenste immuunreacties6,7.
De beperkingen van de huidige therapeutische strategieën hebben geleid tot een grotere nadruk op de regeneratie van DpN als een potentiële benadering bij de behandeling van PD. Regeneratie van DpN of neuroregeneratie is naar voren gekomen als een van de veelbelovende doorbraken in het beheer van PD, niet alleen vanwege het potentieel als een nieuwe therapeutische methode, maar ook als middel om het mechanisme van de ziekte te begrijpen8, 9. Deze benadering richt zich op het herstel van de neuronale functie door differentiatie, migratie en integratie van bestaande voorlopercellen in het laesiecircuit10. Om neuroregeneratie verder te onderzoeken, zijn verschillende in vivo studies uitgevoerd. Het bleek dat gewervelde dieren zoals zoogdieren, amfibieën en reptielen nieuwe hersencellen genereren na letsel11,12. Onder de gewervelde dieren zijn zoogdieren meer gewild gezien hun genetische gelijkenis met mensen. Zoogdieren vertonen echter een beperkt en slecht herstelvermogen in het centrale zenuwstelsel (CZS) dat tot de volwassenheid kan duren na een hersenletsel13. Over het algemeen zijn zoogdieren ongeschikt als diermodellen voor het begrijpen van neuroregeneratie, aangezien het lage aantal geproduceerde neuronen niet voldoende zal zijn om beschadigde neurale circuits te herstellen die bij PD worden waargenomen. Als zodanig is het op teleost gebaseerde model, met name in zebravissen, zeer begunstigd vanwege zijn hoge proliferatieve snelheid, het vermogen om zichzelf voortdurend te vernieuwen en de hersen homologie met mensen te sluiten14,15.
Zebravis wordt het meest gebruikt om ongeordende bewegingen bij PD16 te bestuderen. Het op zebravissen gebaseerde PD-model wordt meestal geïnduceerd door neurotoxinen, waaronder 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) en 6-hydroxydopamine (6-OHDA)17. Hoewel effectief in het induceren van specifiek verlies van DpN en afname van dopamineniveaus, bootsen MPTP-gebaseerde modellen de omstandigheden van PD niet nauw na, omdat het DpN-verlies niet alleen beperkt is tot het CZS18. Het onvermogen van 6-OHDA om de bloed-hersenbarrière te passeren beperkte de effecten ervan op cellulaire en functionele veranderingen in de hersenen wanneer het intracranieel wordt toegediend in tegenstelling tot intramusculair19. Perifere toediening van 6-OHDA veroorzaakte een wereldwijde verlaging van dopamineniveaus in het hele zenuwstelsel20. Terwijl toediening van 6-OHDA in het hersenvocht ablatie van DpN in het hele CZS21 veroorzaakte, wat niet de aandoening nabootst zoals gezien bij PD waarbij het verlies van DpN specifiek optreedt bij de substantia nigra van het menselijk brein. ICV-toediening van 6-OHDA daarentegen induceerde specifiek significante ablatie van DpN op het gebied van ventrale Dn in het zebravisbrein, dat sterk leek op substantia nigra22. Interessant is dat herstel van DpN 30 dagen na 6-OHDA-geïnduceerde laesie werd gemeld en deze neuronen overleefden in de loop van het leven23,24. Het functionele herstel van DpN werd aangetoond door middel van een locomotorische beoordeling van de afgelegde afstand (cm) en de gemiddelde snelheid (cm / s) met behulp van het 6-OHDA-geïnduceerde pd-model voor volwassenen op basis van zebravissen22.
Het huidige werk demonstreerde met succes de locomotorische beoordeling van het gevestigde 6-OHDA-geïnduceerde, op volwassen zebravissen gebaseerde PD-model. Het hele experiment omvatte drie belangrijke stappen: pre-ICV micro-injectiepreparaten, ICV-micro-injectie van zebravissen en locomotorische beoordeling. Om het gezonde herstel van volwassen zebravissen na de ICV-micro-injectieprocedure en een goed experimenteel resultaat te garanderen, zijn in deze studie enkele goede praktijken voor elke stap aanbevolen.
<p c…The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Hoger Onderwijs Maleisië in het kader van de Fundamental Research Grant Scheme [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
Materials | |||
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
Ascorbic acid | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
Disposable pasteur pipette, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
Microcentrifuge tube, 0.2 mL | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30124332 | |
Nice conical flask, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
Equipment | |||
ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA | – | version 7.0; video tracking software |
Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Göttingen, Germany | SE 2 | |
FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000035 | |
Femtotip II, sterile injection capillary | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242957000 | |
InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000027 | |
LED Portable Lamp | MR. DIY, Selangor, Malaysia | 9023251 | 20 mAh |
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
Shanda aquarium heater | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
Thermometer | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
Video camera | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |