Summary

Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido adiposo de rata para la diferenciación en células productoras de insulina

Published: August 29, 2022
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Summary

Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-MSC) pueden ser una fuente potencial de MSC que se diferencian en células productoras de insulina (IPC). En este protocolo, proporcionamos pasos detallados para el aislamiento y la caracterización de las MSC Ad-MSC epidídimas de ratas, seguidas de un protocolo simple y corto para la generación de IPC a partir de las mismas MSC Ad-MSC de ratas.

Abstract

Las células madre mesenquimales (MSC), especialmente aquellas aisladas del tejido adiposo (MSC Ad), han ganado especial atención como una fuente renovable y abundante de células madre que no plantea ninguna preocupación ética. Sin embargo, los métodos actuales para aislar las MSC Ad no están estandarizados y emplean protocolos complicados que requieren equipos especiales. Se aislaron las MSC Ad-MSC de la grasa epidídima de las ratas Sprague-Dawley utilizando un método simple y reproducible. Las MSC Ad aisladas generalmente aparecen dentro de los 3 días posteriores al aislamiento, ya que las células adherentes muestran morfología fibroblástica. Esas células alcanzan el 80% de confluencia dentro de 1 semana de aislamiento. Posteriormente, en el paso 3-5 (P3-5), se llevó a cabo una caracterización completa para las MSC Ad-MSC aisladas mediante inmunofenotipado para marcadores de superficie característicos del grupo de diferenciación (CD) MSC como CD90, CD73 y CD105, así como inducir la diferenciación de estas células a través de los linajes osteogénico, adipogénico y condrogénico. Esto, a su vez, implica la multipotencia de las células aisladas. Además, inducimos la diferenciación de las Ad-MSC aisladas hacia el linaje de células productoras de insulina (IPC) a través de un protocolo simple y relativamente corto mediante la incorporación del medio Eagle modificado de Dulbecco de alta glucosa (HG-DMEM), β-mercaptoetanol, nicotinamida y exendina-4. La diferenciación de los IPC se evaluó genéticamente, en primer lugar, mediante la medición de los niveles de expresión de marcadores específicos de células β como MafA, NKX6.1, Pdx-1 e Ins1, así como la tinción de ditizona para los IPC generados. En segundo lugar, la evaluación también se llevó a cabo funcionalmente mediante un ensayo de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS). En conclusión, las MSC Ad-MSC se pueden aislar fácilmente, exhibiendo todos los criterios de caracterización de MSC, y de hecho pueden proporcionar una fuente abundante y renovable de IPC en el laboratorio para la investigación de la diabetes.

Introduction

Las células madre mesenquimales (MSC), también conocidas como células del estroma mesenquimal, se encuentran entre los tipos de células más utilizados para la medicina regenerativa 1,2. Se clasifican como células madre adultas y se caracterizan por un potencial de diferenciación multilinaje y capacidad de autorrenovación3. Las MSC se pueden aislar y obtener de diversas fuentes, incluyendo tejido adiposo, médula ósea, sangre periférica, tejido y sangre del cordón umbilical, folículos pilosos y dientes 4,5.

El aislamiento de las células madre del tejido adiposo se considera atractivo y prometedor debido a su fácil acceso, rápida expansión in vitro y alto rendimiento6. Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-MSC) se pueden aislar de diferentes especies como humanos, bovinos, ratones, ratas y, más recientemente, cabras7. Se ha demostrado que las MSC Ad son ahora candidatos potenciales para la ingeniería de tejidos y la terapia génica / celular que incluso se pueden utilizar para desarrollar una alternativa autóloga para la reparación a largo plazo de lesiones o defectos de tejidos blandos 7,8.

La Sociedad Internacional de Terapia Celular y Génica (ISCT) ha definido tres criterios mínimos que deben ser exhibidos por las MSC para la caracterización completa9. Primero, deben ser adherentes al plástico. En segundo lugar, las MSC deben expresar marcadores de superficie de células madre mesenquimales como CD73, CD90 y CD105 y carecer de expresión de los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79α o CD19 y HLA-DR. Finalmente, las MSC deben exhibir la capacidad de diferenciarse en los tres linajes mesenquimales: adipocitos, osteocitos y condrocitos. Curiosamente, las MSC también pueden diferenciarse en otros linajes como células neuronales, cardiomiocitos, hepatocitos y células epiteliales10,11.

De hecho, las MSC poseen propiedades únicas que les permiten ser aplicadas como agentes terapéuticos potenciales en la terapia regenerativa para diferentes enfermedades. Las MSC pueden secretar factores solubles para inducir un ambiente inmunomodulador que proporciona beneficios terapéuticos12. Además, las MSC pueden migrar hacia sitios de lesión y microambientes tumorales para administrar terapia dirigida; sin embargo, los mecanismos no están completamente dilucidados13. Además, las MSC tienen la capacidad de secretar exosomas, vesículas extracelulares en la nanoescala que transportan una carga de ARN no codificantes, proteínas y factores solubles, que últimamente surgieron como un nuevo mecanismo del potencial terapéutico de las MSC en diversas enfermedades14.

Más importante aún, las MSC han generado una marcada atención por su potencial para diferenciarse en células productoras de insulina (IPC), ya sea por modificación genética15,16 o mediante la utilización de varios factores inductores extrínsecos dentro de los medios de cultivo in vitro17. El período de inducción de IPC varía mucho, ya que depende del protocolo de inducción utilizado y de los factores extrínsecos utilizados. El proceso de diferenciación puede durar de días a meses, y requiere una combinación de factores exógenos inductores que deben agregarse y / o retirarse en diferentes etapas. Muchos de estos factores que se han utilizado para la diferenciación pancreática endocrina son compuestos biológicamente activos que han demostrado promover la proliferación o diferenciación/neogénesis de las células β secretoras de insulina y/o aumentar el contenido de insulina de los IPC 18,19,20,21. Cabe destacar aquí que también se ha informado que las MSC tienen efectos terapéuticos en la diabetes y sus complicaciones a través de varios mecanismos, incluido su secretoma, así como una amplia gama de acciones inmunomoduladoras 22,23,24.

En este protocolo, presentamos un protocolo paso a paso detallado para el aislamiento y caracterización de Ad-MSC a partir de grasa epidídima de rata, seguido de un protocolo simple y relativamente corto para la generación de IPC a partir de Ad-MSC.

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Farmacia, la Universidad Británica de Egipto (BUE), El Cairo, Egipto. El protocolo de aislamiento Ad-MSC fue adoptado por López y Spencer, con modificaciones15. 1. Aislamiento de Ad-MSC de almohadillas de grasa epidídima de rata Use ratas macho Sprague-Dawley que pesen 250…

Representative Results

Aislamiento y caracterización de las MSC AdComo se muestra en la Figura 2, las células aisladas del tejido adiposo mostraron una población heterogénea de células redondeadas y similares a fibroblastos a partir del día siguiente de aislamiento (Figura 2A). 4 días después del aislamiento, las células de fibroblastos comenzaron a aumentar en número y tamaño y crecer como una población homogénea por el paso 1 (F…

Discussion

En este protocolo, logramos presentar un protocolo detallado para el aislamiento de Ad-MSCs de grasa epidídima de rata y la diferenciación de estos Ad-MSCs en IPC. De hecho, la grasa epidídima de rata es una fuente fácilmente alcanzable de tejido adiposo para la obtención de Ad-MSC y no requiere ningún equipo especial, ni para la recolección ni para el procesamiento 15,26,27. Las MSC Ad aisladas mostraron una excelente ex…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconocemos al Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Especialista Veterinario, Facultad de Farmacia, Universidad Británica de Egipto (BUE) por ayudar con la disección de las ratas.

También nos gustaría reconocer y apreciar los esfuerzos de la Facultad de Comunicación de Masas, la Universidad Británica en Egipto (BUE) para la producción y edición del video de este manuscrito.

Nos gustaría agradecer a la señorita Fatma Masoud, MSc, profesora asistente de inglés, La Universidad Británica de Egipto (BUE) por la revisión y revisión en inglés del manuscrito.

Este trabajo fue parcialmente financiado por el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CDRD), Facultad de Farmacia, La Universidad Británica de Egipto (BUE), El Cairo, Egipto.

Materials

Albumin, bovine serum Fraction V MP Biomedicals
Alcian Blue 8GX Sigma-Aldrich, USA A3157
Alizarin Red S Sigma-Aldrich, USA A5533
Ammonium hydroxide Fisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITC Stem Cell Technologies 60024FI
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3912
Calcium Chloride Fisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITC Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA MA1-19594
CD34 Polyclonal Antibody Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA PA5-85917
Chloroform Fisher Scientific, USA
Collagenase type I, powder Gibco, Thermo Fisher, USA 17018029
D-Glucose anhydrous, extra pure Fisher Scientific, Germany G/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific, Germany BP231-100
Dithizone staining Sigma-Aldrich, USA D5130
DMEM – High Glucose 4.5 g/L Lonza, Switzerland 12-604F
DMEM – Low Glucose 1 g/L Lonza, Switzerland 12-707F
DMEM/F12 medium Lonza, Switzerland BE12-719F
DNAse/RNAse free water Gibco Thermo Fisher, USA 10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology grade Sigma-Aldrich, Germany 24103
Exendin-4 Sigma-Aldrich, Germany E7144
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco Thermo Fisher, Brazil 10270-106
Formaldehyde 37% Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology grade Fisher Scientific, USA BP2618500
L-Glutamine Gibco Thermo Fisher, USA 25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit R&D systems Inc., MN, USA SC006
Nicotinamide Sigma-Aldrich, Germany N0636
Oil Red Stain Sigma-Aldrich, USA O0625
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin Gibco Thermo Fisher, USA 15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg Lonza, Switzerland BE17-516F
Potassium Chloride Fisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA Kit Cloud-Clone Corp., USA CEA682Ra
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific, Germany
Sodium Chloride Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
SYBR Green Maxima Thermo Scientific, USA K0221
Syringe filter, 0.2 micron Corning, USA 431224
TRIzol Thermo Scientific, USA 15596026
Trypan blue Gibco Thermo Fisher, USA 15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1X Lonza, Switzerland CC-5012
Verso cDNA synthesis kit Thermo Scientific, USA AB-1453/A
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Germany M3148

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Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells. J. Vis. Exp. (186), e63348, doi:10.3791/63348 (2022).

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