Summary

Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Published: December 28, 2021
doi:

Summary

Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd in dit protocol een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren.

Abstract

Drosophila fototransductie is een van de snelst bekende G-eiwit-gekoppelde signaalroutes. Om de specificiteit en efficiëntie van deze cascade te garanderen, bindt het calcium (Ca2+)-permeabele kationkanaal, transient receptor potential (TRP), zich stevig aan het steigereiwit, inactivatie-no-after-potential D (INAD), en vormt een groot signaleringseiwitcomplex met oogspecifiek eiwitkinase C (ePKC) en fosfolipase Cβ/No-receptorpotentiaal A (PLCβ/NORPA). De biochemische eigenschappen van het Drosophila TRP-kanaal blijven echter onduidelijk. Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene TRP-kanaal te zuiveren. Ten eerste werd het gezuiverde histidine (His)-gelabelde NORPA 863-1095-fragment gebonden aan Ni-kralen en gebruikt als lokaas om het endogene INAD-eiwitcomplex uit Drosophila-hoofdhomogenaten naar beneden te halen. Vervolgens werd overmatig gezuiverd glutathion S-transferase (GST)-gelabeld TRP 1261-1275-fragment toegevoegd aan de Ni-kralen om te concurreren met het TRP-kanaal. Ten slotte werd het TRP-kanaal in het supernatant gescheiden van het overmatige TRP 1261-1275-peptide door grootte-uitsluitingschromatografie. Deze methode maakt het mogelijk om het gatingmechanisme van het Drosophila TRP-kanaal te bestuderen vanuit zowel biochemische als structurele hoeken. De elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverde Drosophila TRP-kanalen kunnen ook in de toekomst worden gemeten.

Introduction

Fototransductie is een proces waarbij geabsorbeerde fotonen worden omgezet in elektrische codes van neuronen. Het geeft uitsluitend opsinen en de volgende G-eiwit-gekoppelde signaleringscascade door bij zowel gewervelde als ongewervelde dieren. In Drosophila organiseert scaffold protein inactivation-no-after-potential D (INAD) met behulp van zijn vijf PDZ-domeinen een supramoleculair signaleringscomplex, dat bestaat uit een transient receptor potential (TRP) kanaal, fosfolipase Cβ/No receptor potential A (PLCβ/NORPA) en oogspecifiek eiwitkinase C (ePKC)1. De vorming van dit supramoleculaire signaleringscomplex garandeert de juiste subcellulaire lokalisatie, hoge efficiëntie en specificiteit van Drosophila-fototransductiemachines. In deze complexe, lichtgevoelige TRP fungeren kanalen als downstream effectoren van NORPA en bemiddelen calciuminstroom en de depolarisatie van fotoreceptoren. Eerdere studies toonden aan dat de opening van het Drosophila TRP-kanaal wordt gemedieerd door protonen, verstoring van de lokale lipidenomgeving of mechanische kracht 2,3,4. Het Drosophila TRP-kanaal interageert ook met calmodulin5 en wordt gemoduleerd door calcium door zowel positieve als negatieve feedback 6,7,8.

Tot nu toe waren elektrofysiologische studies over het gatingmechanisme van Drosophila TRP- en TRP-achtige (TRPL) kanalen gebaseerd op weggesneden membraanpleisters, hele-cel opnames van gedissocieerde wild-type Drosophila-fotoreceptoren en hetero-uitgedrukte kanalen in S2-, SF9- of HEK-cellen 2,9,10,11,12,13, maar niet op gezuiverde kanalen. De structurele informatie van het drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte blijft ook onduidelijk. Om de elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverd eiwit in een gereconstitueerde membraanomgeving te bestuderen en structurele informatie te verkrijgen over het Drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte, is het verkrijgen van gezuiverde TRP-kanalen over de volledige lengte de noodzakelijke eerste stap, vergelijkbaar met de methodologieën die worden gebruikt in TRP-kanaalstudies van zoogdieren 14,15,16,17.

Onlangs werd op basis van het assemblagemechanisme van INAD-eiwitcomplex 18,19,20 voor het eerst een affiniteitszuiverings- plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het TRP-kanaal te zuiveren van Drosophila-hoofdhomogenaten door streptavidin-kralen 5. Gezien de lage capaciteit en de dure kosten van streptavidin-kralen, wordt hier een verbeterd zuiveringsprotocol geïntroduceerd dat his-tagged aaseiwit en bijbehorende goedkope Ni-kralen met een veel hogere capaciteit gebruikt. De voorgestelde methode zal helpen om het gatingmechanisme van het TRP-kanaal vanuit structurele hoeken te bestuderen en de elektrofysiologische eigenschappen van het TRP-kanaal te meten met gezuiverde eiwitten.

Protocol

1. Zuivering van GST-gelabelde TRP- en His-tagged NORPA-fragmenten Zuiveren GST-tagged TRP 1261-1275 fragment Transformeer de pGEX 4T-1 TRP 1261-1275plasmide 10 in Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) cellen met behulp van de CaCl2 heat-shock transformatiemethode21. Ent een enkele kolonie in 10 ml Luria Bertani (LB) medium en groei ‘s nachts bij 37 °C. Versterk vervolgens de 10 ml zaaicultuur in 1 L LB-medium bij 37 …

Representative Results

In dit artikel wordt een eiwitzuiveringsmethode gedemonstreerd om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren (figuur 1). Ten eerste worden recombinante eiwitexpressie en -zuivering toegepast om het aas en concurrerende eiwitten te verkrijgen. Vervolgens wordt een GST-gelabeld TRP 1261-1275-fragment uitgedrukt in E. coli BL21 (DE3) -cellen in LB-medium en gezuiverd met glutathionparels en een kolom met grootte-uitsluiting (<strong class="xfig"…

Discussion

INAD, dat vijf PDZ-domeinen bevat, is de kernorganisator van Drosophila-fototransductiemachines. Eerdere studies toonden aan dat INAD PDZ3 bindt aan de TRP-kanaal C-terminale staart met een voortreffelijke specificiteit (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interageert met NORPA 863-1095 fragment met een extreem hoge binding affiniteit (KD = 30 nM). Deze bevindingen bieden een solide biochemische basis voor het ontwerpen van de affiniteitszuivering plus concurrentiestr…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) en natural science foundation van de provincie Guangdong, China (nr. 2021A1515010796) aan W. L. Wij danken LetPub (www.letpub.com) voor haar taalkundige hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.

Materials

Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain Bloomington Drosophila Stock Center BDSC:3605 Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves Jiufeng metal mesh company GB/T6003.1 Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) Lablead A3291 SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate Invitrogen HC2005 SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor Roche 05892953001 Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250 Sangon Biotech A100472-0025 SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT) Sangon Biotech A620058-0100 Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) Sangon Biotech A500838-0500 Size-exclusion column buffer preparation
Glycine Sangon Biotech A610235-0005 SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads Cytiva 17513202 Affinity chromatography
Imidazole Sangon Biotech A500529-0001 Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sangon Biotech A600168-0025 Induction of protein overexpression
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002-0250 E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma-aldrich G4251-100G Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads Cytiva 17371202 Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) Sangon Biotech A610424-001 Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-aldrich T9281-100ML SDS-PAGE gel preparation
PBS Sangon Biotech E607008-0500 Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF Lablead P0754-25G Protease inhibitor
Prestained protein marker Thermo Scientific 26619/26616 Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade) Cytiva 28989336 HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade) Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride Sangon Biotech A501218-0001 Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sangon Biotech A500228-0001 SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base Sigma-aldrich T1503-10KG Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column Millipore UFC901096/801096 Protein concentration
Equipment
Analytical Balance DENVER APX-60 Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes Eppendorf 5810R Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes Eppendorf 5417R Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) Bio-Rad 738-0015 TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) Bio-Rad 738-0017 Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System Bio-Rad Universal Hood II Gel Doc XR System SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge Beckman coulter Avanti J-26 XP Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer UNION-BIOTECH UH-05 Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank Taylor-Wharton CX-100 Drosophila head preparation
Protein purification system Cytiva AKTA purifier Protein purification
Refrigerator (-80°C) Thermo 900GP Drosophila head preparation
Spectrophotometer MAPADA UV-1200 OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000c Determination of protein concentration
Ultracentrifuge Beckman coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge Ultracentrifugation

Referenzen

  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neurowissenschaften. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels. J. Vis. Exp. (178), e63260, doi:10.3791/63260 (2021).

View Video