确定母系表达基因在母体脆皮早期发育中的作用

在胚胎的合子基因组被激活之前，所有早期细胞过程都需要一组母系沉积产物（例如RNA，蛋白质和其他生物分子）¹。这些产品从卵母细胞中过早消耗通常是胚胎致命的。尽管这些基因在发育中很重要，但许多母系表达基因的作用目前尚不清楚。斑马鱼基因编辑技术的进步，如CRISPR-Cas9，能够靶向母系表达的基因²，^3，4。然而，与合子表型相比，母系效应表型的鉴定需要额外的一代，因此需要更多的资源。最近，CRISPR-Cas9的双等位基因编辑能力已被用于筛选注射（F0）胚胎体组织中的胚胎表型，称为“脆皮剂”⁵，⁶，⁷，^8，9^，10。脆皮技术允许对体细胞中的候选基因进行资源高效筛选，促进对发育中特定方面的理解。本文中描述的方案允许在单代中鉴定母系效应表型或“母体脆皮”¹¹。该方案可以通过将引导RNA多路复用到单个基因并促进种系中的双等位基因编辑事件来实现。这些母体脆胚可以通过大体形态表型进行鉴定，并进行初步表征，例如标记细胞边界和DNA模式¹¹。对诱导的INDELs的可观察表型和基本分子特征的结合分析可以预测靶基因在早期发育中的作用。

在斑马鱼中，在受精后的前24小时（hpf），一小群细胞发育成原始生殖细胞，这是种系^12，13，^14，15的前体。在F0雌性埋下的离合器中，恢复的母体脆胚的比例取决于有多少个生殖细胞在靶基因中含有双等位基因编辑事件。一般来说，编辑事件发生在胚胎中越早，在种系中观察到CRISPR-Cas9突变的可能性就越高。在大多数情况下，母体脆皮胚胎的表型来自发育中的卵母细胞中存在的两个母体等位基因的功能丧失。当卵母细胞完成减数分裂时，其中一个母体等位基因通过极体从胚胎中挤出，而另一个等位基因则被掺入母体原核中。多个母体脆皮单倍体的测序将代表种系中存在的有助于表型¹¹ 的突变（插入和/或缺失 （INDEL））的混合物。

以下协议描述了在母系效应基因中创建CRISPR-Cas9突变并使用母体清脆剂方法鉴定相应表型的必要步骤（图1）。第一部分将解释如何有效地设计和创建引导RNA，而第二和第三部分包含通过显微注射创建母体脆片的关键步骤。注射CRISPR-Cas9混合物后，通过PCR筛选注射的胚胎以进行体细胞编辑（第四部分）。一旦注射的F0胚胎发育并达到性成熟，F0雌性就被杂交为野生型雄性，并对其后代进行母系效应表型筛查（第五节）。第六部分包括制作母体脆皮单倍体的说明，这些单倍体可以与Sanger测序相结合以鉴定CRISPR-Cas9诱导的INDEL。此外，讨论还包含可以对协议进行的修改，以提高此方法的灵敏度和功能。