该协议描述了一种建立人血脑屏障(BBB)体 外 模型的方法。内皮细胞和周细胞接种在插入过滤器(血室)的每一侧,星形胶质细胞接种在底孔(脑隔室)中。所表征的模型用于纳米颗粒输运实验。
由于血脑屏障(BBB)的高度特异性和限制性特性,将药物输送到大脑仍然是一个挑战,它控制和限制进入脑实质。然而,随着纳米技术的发展,开发了大量新纳米材料来改善药物输送,这突出了对可靠的 体外 微系统的需求,以预测临床前测定框架中的大脑渗透。这是一种建立微生理系统以仅使用人类细胞模拟BBB的简单方法。在其配置中,该模型由三重培养物组成,包括脑样内皮细胞(BLECs),周细胞和星形胶质细胞,这是以更生理的方式诱导和调节BBB特性所必需的三个主要BBB细胞参与者,而无需紧缩化合物。该模型以 12 孔板形式开发,在三重培养 6 天后准备就绪,具有物理性质、基因和蛋白质表达特征,并用于聚合物纳米凝胶转运测量。该模型可用于健康和病理条件下的广泛实验,是分子和颗粒转运以及细胞间和细胞内运输临床前评估的宝贵工具。
BBB位于脑毛细血管内皮细胞(ECs)水平,控制和调节脑实质的访问,这对于维持脑稳态和神经细胞的功能至关重要1,2。然而,在脑病理学的情况下,无法获得脑实质是制定治疗策略的真正障碍。
BBB EC具有一组复杂的特性,包括密封细胞间隙的紧密连接(TJ)蛋白,与控制跨细胞途径1,2,3的外排泵,特异性转运蛋白和受体系统相关。此外,由于与嵌入BBB EC基底膜中的周细胞和星形胶质细胞的通信,所有这些特性都被诱导和维持,星形胶质细胞的末端脚围绕脑毛细血管1,2,3。因此,考虑到其结构的复杂性以及构成神经血管单位(NVU)的不同细胞类型之间的通讯,体外研究BBB是一项挑战2。此外,不同的细胞类型对于BBB特性的诱导和维持至关重要,因此会影响通过BBB的交叉预测。已经使用大量策略测试了将药物输送到大脑的不同策略,以绕过BBB限制属性4。最近,随着纳米技术的进步,正在开发用于药物载体的新材料5,6。除了更高的负载、降低的毒性和提高药物的生物利用度外,这些新的纳米材料还可以用于特洛伊木马策略的功能化,以穿过BBB并特异性靶向实质5,6中的细胞。在正在评估的不同类型的纳米材料中,纳米凝胶引起了相当大的关注,主要是由于其胶体性质和定制化学结构以引入刺激响应特性的能力7,8,9,10,11,12,13,14,15。
现在开发了体外模型,用于使用人类细胞预测药物大脑渗透的临床前研究16。这些模型的不同设置可用,从单层脑EC到多细胞系统16。考虑到NVU细胞在BBB诱导和维持中的重要性以及对病理环境的协调反应,BBB体外模型需要考虑所有这些主角,以提高预测的相关性2,17。
目前的方法描述了建立人类BBB的三重培养体 外 模型,该模型与人类细胞完全开发以研究特定的细胞和人类分子机制。为了具有生理相关性,该模型由诱导和维持BBB特性所必需的BBB的主要三个细胞参与者(EC,周细胞和星形胶质细胞)组成,而无需使用紧固化合物并显示一组需要被视为 体外 BBB模型的特性16,18。该模型以分隔血液和脑区室的配置建立,适用于药物和颗粒转运的临床前研究,以预测脑渗透。通过测量聚合物纳米凝胶的传输来说明该模型的有用性。
考虑到药物难以越过BBB以达到脑实质中的细胞和分子靶标,脑部疾病的治疗仍然是一个挑战。
脑部疾病的药物开发目前表现出较低的成功率,因为在临床前模型中显示出有希望的结果的大多数药物在临床上使用时都没有显示出任何益处。遵循旨在减少用于实验的动物数量的“3R规则”,开发了BBB的 体外 模型来研究大脑病理并预测药物的大脑渗透29。BBB的 体外 模型主要使用动物细胞开发,并且变得更加复杂以提高所获得结果的相关性16。使用人类细胞的重大进步之一,在细胞和分子水平上为研究人类疾病机制带来了不可否认的新见解和更高的特异性16。然而,相关模型的开发需要考虑BBB 体外 模型设置的改进以及动物模型产生的知识。因此,需要考虑BBB结构的复杂性以及细胞-细胞通讯在生理和病理条件下研究BBB的重要性30。
这里介绍的协议描述了一种建立完整的人BBB 体外 模型的方法,该模型包括BBB的三种主要细胞类型,而不受访问脑组织的限制。作为一种多细胞系统,BBB特性的诱导和维持,无需人工使用紧固化合物,而是通过细胞间通讯诱导,在生理上更具有相关性,并且符合 体内 诱导BBB特性31。因此,尊重协议的时间顺序对于协议的成功至关重要。此外,三重培养设置期间和组装三种细胞类型后的孵育时间代表了方案的主要关键步骤。
EC中的BBB特性是由与周细胞共培养诱导的,如共培养模型24所述。因此,插入过滤器背面的周细胞培养是最关键的点,需要严格遵守协议,冒着没有足够的周细胞来诱导BBB特性的风险。首先,在包衣过程和细胞接种过程中,必须注意不要让培养皿的覆盖物与包衣和培养基接触,一旦细胞接种,以确保过滤器的良好涂层并且不会丢失细胞(步骤2.2.1和2.2.4)。此外,一旦周细胞接种,必须等待周细胞附着的指定时间(步骤2.2.4),然后再恢复插入过滤器以在另一侧包被和接种ECs(步骤2.2.5和2.3)。接种后,需要六天通过细胞间通讯诱导BBB特性(步骤2.4)。
该模型在受限渗透率(与紧密连接设置相关)方面进行了验证,因为三重培养模型的EC显示BBB完整性标记的渗透率值类似于验证的共培养模型,并且在经过验证的动物或人类模型中也进行了测量16,27,32。此外,体外BBB模型的验证除了限制通透性外,还需要对NVU的其他细胞类型的响应性以及功能受体和转运蛋白的表达16。此外,该模型具有可重复性,可生成多个插入过滤器和孔,以分别对每种细胞类型进行大量分析(基因和蛋白质表达、荧光染色、毒性测试),而无需细胞分选方法。
该模型是使用0.4μm孔径过滤器开发的,在插入过滤器的每一侧都有一个细胞类型。插入过滤系统允许通过在含有良好物质的星形胶质细胞上转移来研究生理条件下的细胞 – 细胞通讯。与初始体外共培养模型24相比,系统中星形胶质细胞的存在代表了一个加值。事实上,考虑到星形胶质细胞在BBB生理学中的重要性,这第三种细胞类型允许进一步了解BBB内的细胞 – 细胞通讯。此外,三细胞培养系统也可以在中风等病理条件下进行研究,其中星形胶质细胞在其中起着至关重要的作用33,34,35。此外,插入过滤器两侧的BLEC/周细胞的设计可以很容易地放置在其他细胞类型上,以模拟病理状况,例如脑癌23。
插入过滤器的孔径可能会给某些实验带来限制,例如跨BBB的细胞迁移。然而,具有较大孔径的模型的开发需要调整协议以确保形成生理单层EC而不是多层,这与模仿BBB36在生理上无关。
该模型的适用性已通过NGs转运实验得到证明,展示了使用多细胞系统进行转运实验的可能性。然而,人们应该意识到在运输实验中使用对照化合物或分子的困难,与NG具有可比的性质,因为每个纳米结构都表现出一组独特的性质(分子量,电荷,形状,物理性质,蛋白质电晕形成)。
该模型的一个局限性是没有剪切应力,这已被证明会影响EC的分化和TJ蛋白的表达37。然而,考虑到在多细胞系统中添加需要特定设备的流体部分的复杂性,开发模拟脑毛细血管的流体系统具有挑战性。此外,特定装置通常不是市售的,并且不允许多次复制,从而使流体系统不太适合高通量使用。
总之,这种由人类细胞组成的三重培养系统在 体外 复制了BBB的结构。它允许生成许多插入片段,可用于化合物的广泛筛选。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由欧盟地平线2020研究和创新计划根据赠款协议No 764958授予,作为NANOSTEM项目的一部分,这是一个Marie Skłodowska-Curie创新培训网络(ITN)(Fellowship Eleonora Rizzi)。这项研究由“北加来地区理事会”(克莱门斯·德利涅研究金)、“法国儿童和青少年癌症防治协会”(SFCE)、“马丁星辰”协会和“卡桑德拉反白细胞协会”授予。
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |