يصف هذا البروتوكول طريقة لإنشاء حاجز دموي دماغي بشري (BBB) في نموذج المختبر . يتم زرع الخلايا البطانية والخلايا المحيطة على كل جانب من جوانب مرشح الإدراج (حجرة الدم) ، ويتم زرع الخلايا النجمية في البئر السفلي (حجرة الدماغ). تم استخدام النموذج المميز لتجارب نقل الجسيمات النانوية.
لا يزال توصيل الأدوية إلى الدماغ يمثل تحديا بسبب الخصائص المحددة والمقيدة للغاية للحاجز الدموي الدماغي (BBB) ، والتي تتحكم في الوصول إلى حمة الدماغ وتقيد الوصول إليها. ومع ذلك ، مع تطور تقنيات النانو ، تم تطوير لوحات كبيرة من المواد النانوية الجديدة لتحسين توصيل الأدوية ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى أنظمة دقيقة موثوقة في المختبر للتنبؤ باختراق الدماغ في إطار الفحوصات قبل السريرية. فيما يلي طريقة مباشرة لإعداد نظام فسيولوجي دقيق لنمذجة BBB باستخدام الخلايا البشرية فقط. في تكوينه ، يتكون النموذج من ثقافة ثلاثية بما في ذلك الخلايا البطانية الشبيهة بالدماغ (BLECs) ، والخلايا المحيطة ، والخلايا النجمية ، وهي الجهات الفاعلة الخلوية الرئيسية الثلاثة BBB اللازمة لحث وتنظيم خصائص BBB بطريقة فسيولوجية أكثر دون الحاجة إلى تشديد المركبات. يتميز النموذج الذي تم تطويره في شكل لوحة من 12 بئرا ، جاهزا بعد 6 أيام من الثقافة الثلاثية ، بالخصائص الفيزيائية والجينات وتعبيرات البروتين ويستخدم لقياس نقل nanogel البوليمري. يمكن استخدام النموذج لمجموعة واسعة من التجارب في الحالات الصحية والمرضية ويمثل أداة قيمة للتقييمات قبل السريرية لنقل الجزيئات والجسيمات ، وكذلك الاتجار بين الخلايا وداخلها.
BBB ، المترجمة على مستوى الخلايا البطانية الشعرية في الدماغ (ECs) ، تتحكم في الوصول إلى حمة الدماغ وتنظمها ، وهو أمر بالغ الأهمية للحفاظ على توازن الدماغ ووظيفة الخلايا العصبية 1,2. ومع ذلك ، في حالة أمراض الدماغ ، يمثل عدم الوصول إلى حمة الدماغ عقبة حقيقية أمام تطوير استراتيجيات علاجية.
تمتلك BBB ECs مجموعة معقدة من الخصائص ، بما في ذلك بروتينات التقاطع الضيق (TJ) ، التي تغلق الفضاء بين الخلايا ، المرتبط بنظام من مضخات التدفق السائلة ، والناقلات المحددة ، والمستقبلات ، التي تتحكم في المسار عبر الخلوي1،2،3. علاوة على ذلك ، يتم تحفيز كل هذه الخصائص والحفاظ عليها ، وذلك بفضل الاتصالات مع الخلايا المحيطة المضمنة في الغشاء السفلي BBB EC والخلايا النجمية ، التي تحيط أقدامها النهائية بالشعيرات الدموية في الدماغ1،2،3. وبالتالي ، فإن دراسة BBB في المختبر تمثل تحديا بالنظر إلى تعقيد بنيتها والاتصالات بين أنواع الخلايا المختلفة التي تشكل وحدة الأوعية الدموية العصبية (NVU)2. علاوة على ذلك ، فإن أنواع الخلايا المختلفة ضرورية لتحريض وصيانة خصائص BBB وبالتالي تؤثر على التنبؤ بالعبور عبر BBB. تم بالفعل اختبار استراتيجيات مختلفة لتوصيل الدواء إلى الدماغ باستخدام مجموعة كبيرة من التكتيكات لتجاوز خصائص BBB المقيدة4. في الآونة الأخيرة ، مع تقدم تقنيات النانو ، يتم تطوير مواد جديدة للتطبيقات كناقلات للأدوية 5,6. بالإضافة إلى حمولتها الأعلى ، وانخفاض سميتها ، وزيادة التوافر البيولوجي للأدوية ، يمكن تشغيل هذه المواد النانوية الجديدة لاستراتيجية حصان طروادة لعبور BBB واستهداف الخلايا على وجه التحديد في حمة 5,6. من بين الأنواع المختلفة من المواد النانوية التي يتم تقييمها ، جذبت المواد الهلامية النانوية اهتماما كبيرا ، ويرجع ذلك أساسا إلى خصائصها الغروية وقدرتها على تكييف التركيب الكيميائي لإدخال خصائص تستجيب للمحفزات7،8،9،10،11،12،13،14،15.
يتم الآن تطوير نماذج في المختبر للدراسات قبل السريرية باستخدام الخلايا البشرية للتنبؤ باختراق الدماغ للأدوية16. تتوفر إعدادات مختلفة لهذه النماذج ، من الطبقات الأحادية من ECs الدماغية إلى أنظمة الخلايا المتعددة16. بالنظر إلى أهمية خلايا NVU في تحريض BBB وصيانته والاستجابة المنسقة للبيئة المرضية ، تحتاج نماذج BBB في المختبر إلى النظر في كل هؤلاء الأبطال لتحسين أهمية التنبؤ 2,17.
تصف الطريقة الحالية إعداد نموذج ثلاثي للزراعة في المختبر ل BBB البشري ، والذي تم تطويره بالكامل مع الخلايا البشرية لدراسة آليات جزيئية خلوية وبشرية محددة. لكي يكون النموذج ذا صلة فسيولوجية ، يتكون من الجهات الفاعلة الخلوية الثلاثة الرئيسية ل BBB (ECs ، pericytes ، والخلايا النجمية) اللازمة للحث على خصائص BBB والحفاظ عليها ، دون استخدام مركبات التشديد وعرض مجموعة من الخصائص المطلوبة للنظر فيها كنموذج BBB في المختبر 16,18. تم إعداد النموذج في تكوين يحدد حجرة الدم والدماغ ، وهو مناسب للدراسات قبل السريرية لنقل الأدوية والجسيمات للتنبؤ باختراق الدماغ. يتم توضيح فائدة النموذج من خلال قياس نقل المواد الهلامية النانوية البوليمرية.
لا يزال علاج أمراض الدماغ يمثل تحديا بالنظر إلى صعوبة الأدوية في التغلب على BBB للوصول إلى أهدافها الخلوية والجزيئية في حمة الدماغ.
يظهر تطوير الأدوية لأمراض الدماغ حاليا معدل نجاح منخفض لأن معظم الأدوية التي تعرض نتائج واعدة في النماذج قبل السريرية فشلت في إظهار أي فائدة عند استخدامها في العيادة. باتباع “قاعدة 3R” ، التي تهدف إلى تقليل عدد الحيوانات المستخدمة في التجريب ، يتم تطوير نماذج في المختبر من BBB لدراسة أمراض الدماغ والتنبؤ باختراق الدماغ للعقاقير29. تم تطوير نماذج BBB في المختبر بشكل رئيسي باستخدام الخلايا الحيوانية وأصبحت أكثر تطورا لتحسين أهمية النتائج التي تم الحصول عليها16. أحد التطورات الهامة في استخدام الخلايا البشرية ، والتي تجلب رؤية جديدة لا يمكن إنكارها والمزيد من التحديد ، على المستويين الخلوي والجزيئي ، لدراسة آليات الأمراض البشرية16. ومع ذلك ، فإن تطوير النماذج ذات الصلة يتطلب النظر في تحسين إعدادات نموذج BBB في المختبر والمعرفة الناشئة ، وذلك بفضل النماذج الحيوانية. وبالتالي ، فإنه يحتاج إلى النظر في تعقيد بنية BBB وأهمية الاتصالات الخلوية الخلوية لدراسة BBB في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية30.
يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة لإعداد نموذج BBB البشري الكامل في المختبر الذي يضم أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة ل BBB ، دون قيود على الوصول إلى أنسجة المخ. كنظام متعدد الخلايا ، فإن الحث والحفاظ على خصائص BBB ، دون الاستخدام الاصطناعي لمركبات التشديد ، ولكن بدلا من ذلك تسببه اتصالات الخلايا الخلوية أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية ويتماشى مع الحث في الجسم الحي لخصائص BBB31. ومن ثم، فإن احترام التسلسل الزمني للبروتوكول يكتسي أهمية قصوى لنجاح البروتوكول. علاوة على ذلك ، تمثل أوقات الحضانة أثناء إعداد الثقافة الثلاثية وبمجرد تجميع أنواع الخلايا الثلاثة الخطوات الحاسمة الرئيسية للبروتوكول.
يتم تحفيز خصائص BBB في ECs من خلال الثقافة المشتركة مع pericytes ، كما هو موضح لنموذج الثقافة المشتركة24. وبالتالي ، فإن ثقافة pericytes في الجانب الخلفي من مرشح الإدراج هي النقطة الأكثر أهمية وتتطلب اتباع البروتوكول بدقة في خطر عدم وجود ما يكفي من pericytes لتحريض خصائص BBB. بادئ ذي بدء ، أثناء إجراء الطلاء وكذلك بذر الخلايا ، يجب الانتباه إلى عدم ملامسة غطاء طبق بتري للطلاء وكذلك الوسط بمجرد زرع الخلايا لضمان طلاء جيد للمرشح وعدم فقدان الخلايا (الخطوتان 2.2.1 و 2.2.4). علاوة على ذلك ، بمجرد زرع الخلايا المحيطة ، من الضروري الانتظار في الوقت المحدد لربط الخلايا المحيطة (الخطوة 2.2.4) قبل الرجوع إلى مرشح الإدراج لطلاء وبذر ECs على الجانب الآخر (الخطوتان 2.2.5 و 2.3). بمجرد البذر ، هناك حاجة إلى ستة أيام لتحفيز خصائص BBB من خلال اتصالات الخلايا الخلوية (الخطوة 2.4).
يتم التحقق من صحة النموذج من حيث النفاذية المقيدة (المرتبطة بإعداد التقاطعات الضيقة) نظرا لأن ECs لنموذج الثقافة الثلاثية تعرض قيم نفاذية لعلامات سلامة BBB مماثلة لنموذج الاستزراع المشترك الذي تم التحقق منه ويتم قياسه أيضا في النماذج الحيوانية أو البشرية التي تم التحقق منها16،27،32. علاوة على ذلك ، يتطلب التحقق من صحة نموذج BBB في المختبر ، بالإضافة إلى النفاذية المحدودة ، الاستجابة لأنواع الخلايا الأخرى من NVU والتعبير عن المستقبلات الوظيفية والناقلات16. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النموذج قابل للتكرار وينتج العديد من مرشحات الإدراج والآبار لإجراء العديد من التحليلات (التعبير الجيني والبروتيني ، تلطيخ الفلورسنت ، اختبارات السمية) على كل نوع من الخلايا على حدة دون الحاجة إلى طريقة فرز الخلايا.
تم تطوير النموذج باستخدام مرشح بحجم المسام 0.4 ميكرومتر ليكون له نوع خلية واحد على كل جانب من جوانب مرشح الإدراج. سمح نظام مرشح الإدراج بدراسة الاتصالات الخلوية الخلوية في الظروف الفسيولوجية عن طريق نقلها على الخلايا النجمية المحتوية بشكل جيد. يمثل وجود الخلايا النجمية في النظام قيمة زائدة مقارنة بالزراعة المشتركة الأولية في المختبر نموذج24. في الواقع ، بالنظر إلى أهمية الخلايا النجمية في فسيولوجيا BBB ، فإن هذا النوع الثالث من الخلايا يسمح بمزيد من الفهم لاتصالات الخلايا الخلوية داخل BBB. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا دراسة نظام زراعة الخلايا الثلاثية في الحالات المرضية مثل السكتة الدماغية ، حيث تلعب الخلايا النجمية دورا أساسيا33،34،35. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن بسهولة وضع تصميم BLECs / pericytes على جانبي مرشح الإدراج على أنواع الخلايا الأخرى لتقليد الحالات المرضية مثل سرطان الدماغ23.
يمكن أن يؤدي حجم مسام مرشح الإدراج إلى فرض قيود مع بعض التجارب، مثل ترحيل الخلايا عبر BBB. ومع ذلك ، فإن تطوير النموذج بحجم مسام أكبر يتطلب تكييف البروتوكول لضمان تكوين طبقة أحادية فسيولوجية من ECs وليس طبقات متعددة ، والتي ليست ذات صلة فسيولوجية لتقليد BBB36.
وقد تم إثبات قابلية تطبيق النموذج باستخدام تجربة نقل NGs التي تظهر إمكانية إجراء تجربة نقل باستخدام نظام متعدد الخلايا. ومع ذلك ، ينبغي للمرء أن يكون على دراية بالصعوبات في وجود مركب أو جزيء تحكم لتجربة النقل ، وتقاسم خصائص مماثلة مع NGs لأن كل بنية نانوية تظهر مجموعة فريدة من الخصائص (الوزن الجزيئي ، الشحنة ، الشكل ، الخصائص الفيزيائية ، تكوين كورونا البروتين).
أحد قيود النموذج هو عدم وجود إجهاد القص ، والذي ثبت أنه يؤثر على تمايز ECs والتعبير عن بروتينات TJ37. ومع ذلك ، فإن تطوير نظام سائل يحاكي الشعيرات الدموية في الدماغ يمثل تحديا بالنظر إلى تعقيد إضافة جزء سائل ، يتطلب جهازا معينا ، في نظام متعدد الخلايا. علاوة على ذلك ، عادة ما يكون الجهاز المعين غير متاح تجاريا ولا يسمح بالعديد من النسخ المتماثلة ، مما يجعل الأنظمة المائعة أقل تكيفا للاستخدام عالي الإنتاجية.
باختصار ، هذا النظام الثلاثي للزراعة الذي يتكون من خلايا بشرية يستنسخ في المختبر بنية BBB. يسمح بتوليد العديد من الإدخالات التي يمكن استخدامها لفحص شامل للمركبات.
The authors have nothing to disclose.
يتم منح هذا العمل من قبل برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة No 764958 ، كجزء من مشروع NANOSTEM ، وهي شبكة ماري سكلودوفسكا-كوري للتدريب المبتكر (ITN) (زمالة إليونورا ريزي). وتمنح هذه الدراسة من قبل “المجلس الإقليمي لبلدان الشمال – باس – دو كاليه” (زمالة كليمانس ديلين)، و “الجمعية الفرنسية لمكافحة السرطان و لوسيمات الطفل والمراهقين” (SFCE)، وجمعية “النجم دي مارتن” وجمعية “كاساندرا لمكافحة الليوسيمي”.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |