Isolering, formering og identifikation af bakteriearter med kulbrintemetaboliserende egenskaber fra akvatiske levesteder
Summary
Vi præsenterer processen med at isolere, formere og karakterisere kulbrintenedbrydende bakterier fra akvatiske levesteder. Protokollen skitserer bakteriel isolering, identifikation ved 16S rRNA-metoden og test af deres carbonhydridnedbrydende potentiale. Denne artikel vil hjælpe forskere med at karakterisere mikrobiel biodiversitet i miljøprøver og specifikt screene for mikrober med bioremedieringspotentiale.
Abstract
Forurenende kulbrinter er genstridige over for nedbrydning, og deres ophobning i miljøet er giftig for alle livsformer. Bakterier koder for adskillige katalytiske enzymer og er naturligt i stand til at metabolisere kulbrinter. Forskere udnytter biodiversiteten i akvatiske økosystemer til at isolere bakterier med bionedbrydning og bioremedieringspotentiale. Sådanne isolater fra miljøet giver et rigt sæt metaboliske veje og enzymer, som yderligere kan udnyttes til at opskalere nedbrydningsprocessen i industriel skala. I denne artikel skitserer vi den generelle proces med isolering, formering og identifikation af bakteriearter fra akvatiske levesteder og screener deres evne til at udnytte kulbrinter som den eneste kulstofkilde in vitro ved hjælp af enkle teknikker. Denne protokol beskriver isoleringen af forskellige bakteriearter og deres efterfølgende identifikation ved hjælp af 16S rRNA-analysen. Protokollen præsenterer også trin til karakterisering af kulbrintenedbrydningspotentialet for bakterielle isolater. Denne protokol vil være nyttig for forskere, der forsøger at isolere bakteriearter fra miljømæssige levesteder til deres bioteknologiske anvendelser.
Introduction
Kulbrinter (HC) anvendes i vid udstrækning både som brændstoffer og i kemiske applikationer. Aromatiske kulbrinter såsom benzen, toluen og xylen anvendes i vid udstrækning som opløsningsmidler1. Alkener, såsom ethylen og propylen, tjener som forstadier i syntesen af henholdsvis polyethylen- og polypropylenpolymerer. Polymerisation af et andet carbonhydrid, styren danner polystyren. Antropogene aktiviteter introducerer kulbrinter i miljøet under deres produktion og transport. Kulbrinteforurening af jord og vand giver anledning til alvorlig bekymring for miljøet og menneskers sundhed. Mikrober spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af økosystemet ved at regulere de biogeokemiske cyklusser og udnytte en bred vifte af substrater, som også omfatter forurenende stoffer og xenobiotika, og omdanne dem til kulstof og energikilde. Denne proces med afgiftning af miljøforurenende stoffer af mikroorganismer er kendt som bioremediering 3,4,5,6,7.
Mikroorganismer med evne til at nedbryde kulbrinter findes i vand- og jordhabitater 8,9,10. Mange bakterier med potentiale til at nedbryde alkaner og aromatiske HC’er er blevet identificeret, såsom Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter og Oleibacter11. Udviklingen af teknologisk avancerede kulturuafhængige tilgange har bidraget til at opdage nye HC-nedbrydende mikrobielle samfund12. Genomisk materiale, der er direkte isoleret fra kildeprøver, amplificeres og sekventeres ved hjælp af metoder med høj kapacitet såsom Next Generation Sequencing (NGS) efterfulgt af analyse, hvilket eliminerer behovet for at dyrke mikroorganismer. NGS-metoder, såsom metagenomanalyse, er dyre og lider af ulemper relateret til amplifikationsprocessen13. Dyrkningsteknikker såsom selektiv berigelseskultur14, der sigter mod isolering af carbonhydridnedbrydende mikrober, er stadig nyttige, da de giver forskere mulighed for at undersøge og manipulere metaboliske veje i bakterieisolater.
Genomisk DNA-isolering og efterfølgende sekventering af det genomiske materiale afslører værdifuld information om enhver organisme. Helgenomsekventering hjælper med at identificere gener, der koder for antibiotikaresistens, potentielle lægemiddelmål, virulensfaktorer, transportører, xenobiotisk metaboliserende enzymer osv.15,16,17. Sekventering af 16SrRNA-kodende gen har vist sig at være en robust teknik til at identificere bakteriel fylogeni. Bevarelse af gensekvensen og funktionen gennem årene gør det til et pålideligt værktøj til at identificere ukendte bakterier og sammenligne et isolat med de nærmeste arter. Desuden er længden af dette gen optimal til bioinformatikanalyse18. Alle disse funktioner sammen med den lette genamplifikation ved hjælp af universelle primere og forbedring af gensekventeringsteknologi gør det til en guldstandard til identifikation af mikrober.
Her beskriver vi en procedure til genvinding af dyrkbare mikroorganismer med HC-nedbrydende potentiale fra miljøprøver. Metoden beskrevet nedenfor skitserer indsamling og identifikation af HC-nedbrydende bakterier og er opdelt i fem sektioner: (1) indsamling af bakterier fra vandprøver, (2) isolering af rene kulturer, (3) undersøgelse af HC-nedbrydende evne af bakterielle isolater, (4) genomisk DNA-isolering og (5) identifikation baseret på 16S rRNA-gensekventering og BLAST-analyse. Denne procedure kan tilpasses til at isolere bakterier til mange forskellige bioteknologiske anvendelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er velkendt, at kun ca. 1% af bakterierne på Jorden let kan dyrkes i laboratoriet6. Selv blandt de dyrkbare bakterier forbliver mange ukarakteriserede. Forbedringer i molekylære metoder har givet en ny dimension til analyse og evaluering af bakteriesamfund. Sådanne teknikker har dog begrænsninger, men de gør ikke kulturanalyserne overflødige. Rene kulturteknikker til isolering af individuelle bakteriearter forbliver den primære mekanisme til karakterisering af fysiologiske egenskaber. J…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Karthik Krishnan og medlemmer af RP-laboratoriet for deres nyttige kommentarer og forslag. DS er støttet af SNU-Doctoral fellowship og Earthwatch Institute India Fellowship. RP lab er støttet af et CSIR-EMR-tilskud og opstartsmidler fra Shiv Nadar University.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
Referenzen
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. , 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
- R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
