Summary

Aislamiento, propagación e identificación de especies bacterianas con propiedades metabolizadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos

Published: December 07, 2021
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Summary

Presentamos el proceso de aislamiento, propagación y caracterización de bacterias degradadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos. El protocolo describe el aislamiento bacteriano, la identificación mediante el método de ARNr 16S y las pruebas de su potencial de degradación de hidrocarburos. Este artículo ayudaría a los investigadores a caracterizar la biodiversidad microbiana en muestras ambientales y, específicamente, a detectar microbios con potencial de biorremediación.

Abstract

Los hidrocarburos contaminantes son recalcitrantes a la degradación y su acumulación en el medio ambiente es tóxica para todas las formas de vida. Las bacterias codifican numerosas enzimas catalíticas y son naturalmente capaces de metabolizar hidrocarburos. Los científicos aprovechan la biodiversidad de los ecosistemas acuáticos para aislar bacterias con potencial de biodegradación y biorremediación. Estos aislados del medio ambiente proporcionan un rico conjunto de vías metabólicas y enzimas, que pueden utilizarse aún más para ampliar el proceso de degradación a escala industrial. En este artículo, describimos el proceso general de aislamiento, propagación e identificación de especies bacterianas de hábitats acuáticos y evaluamos su capacidad para utilizar hidrocarburos como única fuente de carbono in vitro utilizando técnicas simples. El presente protocolo describe el aislamiento de diversas especies bacterianas y su posterior identificación mediante el análisis de ARNr 16S. El protocolo también presenta pasos para caracterizar el potencial de degradación de hidrocarburos de los aislados bacterianos. Este protocolo será útil para los investigadores que intentan aislar especies bacterianas de hábitats ambientales para sus aplicaciones biotecnológicas.

Introduction

Los hidrocarburos (HC) se utilizan ampliamente como combustibles y en aplicaciones químicas. Los hidrocarburos aromáticos como el benceno, el tolueno y el xileno se utilizan ampliamente como disolventes1. Alquenos como el etileno y el propileno sirven como precursores en la síntesis de polímeros de polietileno y polipropileno, respectivamente. La polimerización de otro hidrocarburo, el estireno forma poliestireno. Las actividades antropogénicas introducen hidrocarburos en el medio ambiente durante su producción y transporte. La contaminación del suelo y el agua por hidrocarburos preocupa seriamente el medio ambiente y la salud humana. Los microbios desempeñan un papel importante en el mantenimiento del ecosistema mediante la regulación de los ciclos biogeoquímicos y la utilización de una amplia gama de sustratos, que incluyen también contaminantes y xenobióticos, convirtiéndolos en carbono y fuente de energía. Este proceso de desintoxicación de contaminantes ambientales por microorganismos se conoce como biorremediación 3,4,5,6,7.

Los microorganismos con capacidad para degradar hidrocarburos se encuentran en hábitats acuáticos y edáficos 8,9,10. Se han identificado muchas bacterias con el potencial de degradar alcanos y HC aromáticos, como Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter y Oleibacter11. El desarrollo de enfoques tecnológicamente avanzados e independientes de la cultura ha ayudado a descubrir nuevas comunidades microbianas que degradan el HC12. El material genómico aislado directamente de las muestras de origen se amplifica y secuencia mediante métodos de alto rendimiento, como la secuenciación de nueva generación (NGS), seguida de un análisis, lo que elimina la necesidad de cultivar microorganismos. Los métodos de NGS, como el análisis del metagenoma, son caros y sufren inconvenientes relacionados con el proceso de amplificación13. Las técnicas de cultivo, como el cultivo de enriquecimiento selectivo14, que tienen como objetivo el aislamiento de microbios que degradan hidrocarburos, siguen siendo útiles, ya que permiten a los investigadores sondear y manipular las vías metabólicas en aislados bacterianos.

El aislamiento del ADN genómico y la posterior secuenciación del material genómico revelan información valiosa sobre cualquier organismo. La secuenciación del genoma completo ayuda en la identificación de genes que codifican la resistencia a los antibióticos, posibles dianas farmacológicas, factores de virulencia, transportadores, enzimas metabolizadoras de xenobióticos, etc.15,16,17. Se ha demostrado que la secuenciación del gen que codifica el 16SrRNA es una técnica robusta para identificar la filogenia bacteriana. La conservación de la secuencia y la función del gen a lo largo de los años lo convierte en una herramienta fiable para identificar bacterias desconocidas y comparar un aislado con las especies más cercanas. Además, la longitud de este gen es óptima para el análisis bioinformático18. Todas estas características, junto con la facilidad de amplificación de genes mediante cebadores universales y la mejora en la tecnología de secuenciación de genes, lo convierten en un estándar de oro para la identificación de microbios.

En este trabajo se describe un procedimiento para recuperar microorganismos cultivables con potencial de degradación de HC a partir de muestras ambientales. El método que se describe a continuación describe la recolección e identificación de bacterias degradadoras de HC y se divide en cinco secciones: (1) recolección de bacterias a partir de muestras de agua, (2) aislamiento de cultivos puros, (3) exploración de la capacidad de degradación de HC de aislados bacterianos, (4) aislamiento de ADN genómico y (5) identificación basada en la secuenciación del gen 16S rRNA y el análisis BLAST. Este procedimiento se puede adaptar para aislar bacterias para muchas aplicaciones biotecnológicas diferentes.

Protocol

1. Recolección, procesamiento y análisis de muestras NOTA: A continuación, presentamos un protocolo para aislar bacterias de hábitats acuáticos. Algunos de los aislados pueden ser patógenos, por lo tanto, use guantes y desinfecte el área de trabajo antes y después de su uso. Recoja 500 ml de muestra de agua en cinco botellas de vidrio estériles de diferentes sitios del cuerpo de agua. Mida el pH y la temperatura de cada muestra con un medidor de pH y un term…

Representative Results

En la Figura 1 se representa el esquema que describe todo el procedimiento para el aislamiento y cribado de bacterias de hábitats acuáticos y su posterior identificación mediante análisis de ARNr 16S. Se recogieron muestras de agua de un humedal en Dadri, India, en botellas de vidrio estériles e inmediatamente se llevaron al laboratorio para su procesamiento. Las muestras se pasaron a través de láminas de filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm, y los papeles de fi…

Discussion

Está bien establecido que solo aproximadamente el 1% de las bacterias de la Tierra se pueden cultivar fácilmente en el laboratorio6. Incluso entre las bacterias cultivables, muchas permanecen sin caracterizar. Las mejoras en los métodos moleculares han dado una nueva dimensión al análisis y evaluación de las comunidades bacterianas. Sin embargo, estas técnicas tienen limitaciones, pero no hacen que los análisis de la cultura sean redundantes. Las técnicas de cultivo puro para aislar espec…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Karthik Krishnan y a los miembros del laboratorio de RP por sus útiles comentarios y sugerencias. DS cuenta con el apoyo de la beca de doctorado de SNU y la beca del Earthwatch Institute India. El laboratorio RP cuenta con el apoyo de una subvención CSIR-EMR y fondos iniciales de la Universidad Shiv Nadar.

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A4718 Gel electrophoresis
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma-Aldrich A9434 Growth medium component
Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A4418 Growth medium component
Bacto-Agar Millipore 1016141000 Solid media preparation
Calcium chloride (CaCl2) MERCK C4901-500G Growth medium component
Catechol Sigma-Aldrich 135011 Hydrocarbon degradation assay
Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB Sigma-Aldrich H6269 Genomic DNA Isolation
Chloroform HIMEDIA MB109 Genomic DNA isolation
Disodium phosphate (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S5136 Growth medium component
EDTA Sigma-Aldrich E9884 gDNA buffer component
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) Sigma-Aldrich 215422 Growth medium component
Glucose Sigma-Aldrich G7021 Growth medium component
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Growth medium component; Glycerol stocks
Isopropanol HIMEDIA MB063 Genomic DNA isolation
LB Agar Difco 244520 Growth medium
Luria-Bertani (LB) Difco 244620 Growth medium
Magnesium sulphate (MgSO4) MERCK M2643 Growth medium component
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) Sigma-Aldrich 221287 Growth medium component
Nutrient Broth (NB) Merck (Millipore) 03856-500G Growth medium
Peptone Merck 91249-500G Growth medium component
Phenol Sigma-Aldrich P1037 Genomic DNA isolation
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786 Growth medium component
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Growth medium component
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2546 Genomic DNA isolation
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 160016235 DNA purification
QIAquick PCR Purification kit QIAGEN 163038783 DNA purification
R2A Agar Millipore 1004160500 Growth medium
SmartSpec Plus Spectrophotometer BIO-RAD 4006221 Absorbance measurement
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Genomic DNA isolation
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 Growth medium component
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma-Aldrich L3771 Genomic DNA isolation
Styrene Sigma-Aldrich S4972 Styrene biodegradation
Taq DNA Polymerase NEB M0273X 16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE) Sigma-Aldrich 93283 Resuspension of genomic DNA
Tryptic Soy Broth (TSB) Merck 22092-500G Growth medium
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG Growth medium component
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) Sigma-Aldrich 221376 Growth medium component

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Diesen Artikel zitieren
Sethi, D., Priyadarshini, R. Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats. J. Vis. Exp. (178), e63101, doi:10.3791/63101 (2021).

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