Проточный цитометрический анализ для идентификации врожденных и адаптивных иммунных клеток мышиных легких

Мышиные дыхательные пути содержат уникальную иммунную систему, отвечающую за борьбу с патогенами и поддержание иммунного гомеостаза. Легочная иммунная система состоит из клеточных популяций со значительной гетерогенностью по фенотипу, функции, происхождению и расположению. Резидентные альвеолярные макрофаги (АМ), происходящие в основном из моноцитов плода, находятся в альвеолярном ^{просвете1}, в то время как интерстициальные макрофаги (ИМ), полученные из костного мозга, находятся в паренхиме ^{легких2}. IM могут быть дополнительно подклассифицированы выражением CD206. CD206⁺ IM заполняют перибронхиальную и периваскулярную область, в то время как CD206-IM расположены в альвеолярном интерстиции3. Недавно было предложено несколько подклассификаций ИМ3,4,5,6. Хотя ИМ менее изучены, чем АМ, последние данные подтверждают их решающую роль в регуляции иммунной системы ^{легких7}. Кроме того, CD206 также выражается в альтернативно активированных ^AMs8.

Легочные дендритные клетки (ДК) являются еще одной гетерогенной группой иммунных клеток легких в отношении их функциональных свойств, местоположения и происхождения. В легких были описаны четыре подкатегории ДК: обычные CD103⁺ DC (также известные как cDC1), обычные CD11b⁺ DC (также известные как cDC2), моноцитарные ДК (MoDC) и плазмоцитоидные DC9,10,11,12,13. Первые три подкласса можно определить как основной комплекс гистосовместимости (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Плазмоцитоидные ДК экспрессируют MHC II и являются промежуточными положительными для CD11c, но экспрессируют высокие уровни B220 и PDCA-19,13,16. В наивных мышиных легких CD103 DC и CD11b DC расположены в интерстиции дыхательных путей, тогда как плазмоцитоидные ДК расположены в альвеолярном ^{интерстиции17}.

Две основные популяции моноцитов находятся в легких во время устойчивого состояния: классические моноциты и неклассические моноциты. Классические моноциты являются Ly6C⁺ и имеют решающее значение для первоначальной воспалительной реакции. Напротив, неклассические моноциты являются Ly6C^– и широко рассматриваются как противовоспалительные клетки3,16,18. Недавно была описана дополнительная популяция моноцитов CD64 ⁺CD16.2⁺, которые происходят из Ly6C-моноцитов и дают начало CD206^{+ IMs3}.

Эозинофилы в основном появляются в легких во время гельминтной инфекции или аллергических состояний. Тем не менее, существует небольшое количество эозинофилов в легочной паренхиме во время устойчивого состояния, известных как резидентные эозинофилы. В отличие от резидентных эозинофилов, воспалительные эозинофилы обнаруживаются в интерстиции легких и бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ). В мышиных моделях клеща домашней пыли (HDM) воспалительные эозинофилы набираются в легкие после антиген-опосредованной стимуляции. Было высказано предположение, что резидентные эозинофилы могут играть регулирующую роль в аллергии, ингибируя сенсибилизацию Т-хелпера 2 (Th2) к ^HDM19.

В отличие от остальных легочных миелоидных клеток, нейтрофилы экспрессируют Ly6G, но не CD68, и характеризуются сигнатурой иммунофенотипа CD68-Ly6G⁺16,20,21. Исследования визуализации показали, что в установившемся состоянии легкое резервирует пул нейтрофилов во внутрисосудистом компартменте и содержит значительное количество внесосудистых нейтрофилов22. Подобно эозинофилам, нейтрофилы не обнаруживаются в БАЛ в установившемся состоянии; однако несколько форм иммунной стимуляции, таких как вызов ЛПС, астма или пневмония, загоняют нейтрофилы в альвеолярный просвет, что приводит к их присутствию в BAL21,22,23.

Значительное количество CD45⁺ клеток легких представляют собой естественный киллер (NK), Т-клетки и В-клетки и являются отрицательными для большинства миелоидных ^{маркеров24}. В легких наивных мышей эти три типа клеток могут быть идентифицированы на основе экспрессии CD11b и MHC ^II18. Около 25% легочных CD45⁺ клеток являются В-клетками, тогда как процент NK-клеток выше в легких, чем в других лимфоидных и нелимфоидных тканях24,25,26. Среди легочных Т-клеток значительную долю составляет ^CD4-CD8– и играет важную роль при респираторных ^{инфекциях26}.

Поскольку в легких находится очень сложная и уникальная иммунная система, было разработано несколько стратегий идентификации иммунных клеток легких16,18,20,27. Стратегия гатинга, описанная в настоящем описании, обеспечивает комплексный и воспроизводимый способ идентификации до 12 различных легочных миелоидных и немиелоидных иммунных популяций с использованием 9 маркеров. Для проверки результатов использовались дополнительные маркеры. Кроме того, предусмотрен подробный способ получения одноклеточной суспензии, которая минимизирует гибель клеток и позволяет идентифицировать наиболее полный профиль иммунно-клеточного компартмента легкого. Следует отметить, что идентификация неиммунных клеток легких, таких как эпителиальные клетки (CD45-CD326⁺CD31^–), эндотелиальные клетки (CD45-CD326-CD31⁺) и фибробласты, требует иного ^{подхода28,29}. Идентификация таких популяций не включена в протокол и метод, описанные здесь.