Imagerie à molécule unique de condensats EWS-FLI1 assemblés sur de l’ADN

La régulation transcriptionnelle est une étape cruciale pour l’expression précise des gènes dans les cellules vivantes. De nombreux facteurs, tels que la modification chromosomique, les facteurs de transcription (TF) et les ARN non codants, participent à ce processus compliqué ^1,2,3. Parmi ces facteurs, les TF contribuent à la spécificité de la régulation transcriptionnelle en reconnaissant et en se liant à des séquences d’ADN spécifiques appelées promoteurs ou amplificateurs, puis en recrutant d’autres protéines fonctionnelles pour activer ou réprimer la transcription 4,5,6,7. La façon dont ces TF parviennent à rechercher leurs sites cibles dans le génome humain et à interagir avec l’ADN recouvert d’histones et de protéines non liant l’ADN aux histones a laissé les scientifiques perplexes pendant des décennies. Au cours des dernières années, plusieurs modèles classiques pour le mécanisme de recherche de cibles des TF ont été construits pour décrire comment ils « glissent », « sautent », « sautent » ou « transfèrent entre segments » le long de la chaîne d’ADN 8,9,10,11. Ces modèles sont axés sur le comportement de recherche sur l’ADN d’une seule molécule TF. Cependant, des études récentes montrent que certains TF subissent une séparation en phase liquide-liquide (LLPS) soit seuls dans le noyau, soit avec le complexe Mediator¹². Les gouttelettes observées de TF sont associées aux régions promotrices ou amplificateurs, mettant en évidence le rôle de la formation de condensats biomoléculaires dans la transcription et le génome tridimensionnel^13,14,15. Ces condensats biomoléculaires sont liés à des compartiments dépourvus de membrane in vivo et in vitro. Elles sont formées via LLPS, dans lesquelles les biomacromolécules modulaires et les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) des protéines sont deux forces motrices principales des interactions multivalentes¹⁶. Ainsi, les TF non seulement recherchent l’ADN, mais fonctionnent également en synergie au sein de ces condensats 4,17,18. À ce jour, la propriété biophysique de ces condensats de transcription sur l’ADN reste incertaine.

Par conséquent, cette étude visait à appliquer une méthode à molécule unique – DNA Curtains – pour imager directement la formation et la dynamique des condensats de transcription formés par les TF sur l’ADN in vitro. DNA Curtains, une plate-forme d’imagerie in vitro à haut débit pour étudier l’interaction entre les protéines et l’ADN, a été appliquée à la réparation de l’ADN 19,20,21, à la recherche de cibles²² et à LLPS 17,23,24. La cellule d’écoulement des rideaux d’ADN est recouverte de bicouches lipidiques biotinylées pour passiver la surface et permettre aux biomolécules de diffuser à la surface. Les motifs en zigzag nanofabriqués limitent le mouvement de l’ADN. Les substrats d’ADN lambda biotinylé peuvent s’aligner le long des bords de la barrière et être étirés par le flux tampon orienté. Les mêmes séquences de début et de fin de toutes les molécules permettent le suivi de la protéine sur l’ADN et décrivent la distribution de position des événements de liaison^25,26. De plus, la combinaison de rideaux d’ADN avec la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM) aide à minimiser le bruit de fond et à détecter les signaux au niveau d’une seule molécule. Ainsi, les rideaux d’ADN pourraient être une méthode prometteuse pour étudier la dynamique de la formation de condensats de transcription sur les motifs d’ADN. Cet article décrit l’exemple d’une oncoprotéine de fusion familiale FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, générée par translocation chromosomique. L’ADN lambda contenant 25× GGAA – la séquence de liaison de EWS-FLI1²⁷ – a été utilisé comme substrat d’ADN dans les expériences DNA Curtains pour observer comment les molécules EWS-FLI1 subissent LLPS sur ADN. Ce manuscrit traite en détail du protocole expérimental et des méthodes d’analyse des données.