De flesta excitatoriska synapserna i centrala nervsystemet ligger på dendritiska ryggrader – små utskjutningar av ett neuronalt membran. Dessa utskjutningar bildar begränsade biokemiska fack som styr intracellulär signaltransduktion. Strukturell plasticitet av dendritiska ryggrader och synapser är nära besläktad med de funktionella förändringarna i synaptisk effekt som ligger till grund för sådana viktiga processer som^{lärande och minne 1,2}. Det är viktigt att notera att elektronmikroskopi (EM) är den enda tekniken som gör det möjligt att avgöra om en dendritisk ryggrad har en presynaptisk ingång. EM-upplösning behövs också för att studera strukturella detaljer såsom form av en postsynaptisk densitet (PSD), som representerar en postsynaptisk del av en synaps eller dimensioner av en dendritisk ryggrad, liksom storleken och formen på en axonal bouton. Dessutom är det möjligt att visualisera synapser och deras omgivning med EM.

Tack vare framsteg inom bild- och datateknik är det möjligt att rekonstruera hela neurala kretsar. Volymelektronmikroskopitekniker, såsom seriell sektionsöverföringselektronmikroskopi (ssTEM), seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBEM) och fokuserad jonstråleskanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) används ofta för neuronala kretsrekonstruktioner³.

I våra studier används SBEM-metoden framgångsrikt för att undersöka den strukturella plasticiteten hos dendritiska ryggrader och PSDs i prover av musen hippocampus och organotypiska hjärnskivor ^4,5. SBEM är baserad på installationen av en miniatyr ultramicrotome inuti scanning elektronmikroskopkammaren^6,7,8,9. Toppen av provblocket avbildas, och sedan skärs provet på ett angivet djup av ultramicrotome, vilket avslöjar en ny block-face, som återigen avbildas och sedan upprepas^{processen 8}. Som ett resultat är det bara bilden av ett block-ansikte kvar medan skivan som har skurits går förlorad som skräp. Det är därför SBEM kallas en destruktiv teknik, vilket innebär att det inte är möjligt att avbilda samma plats igen. Fördelen med de destruktiva blockeringsmetoderna är dock att de inte lider av warpingproblem och sektionsförlust som avsevärt kan påverka datakvaliteten och dataanalysen³. Dessutom ger SBEM möjlighet att avbilda ett relativt stort synfält (> 0,5 mm × 0,5 mm) vid hög upplösning³.

För att använda SBEM måste prover förberedas enligt ett dedikerat, mycket kontrasterande protokoll på grund av den backscattered elektrondetektorn som används för att förvärva bilder. Vi visar här hur man utför provberedning enligt protokollet baserat på ett förfarande utvecklat av Deerinck¹⁰ (National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR) metod), med hjälp av reducerade osmium-thiocarbohydrazide-osmium (rOTO) fläckar som utvecklats på 1980-talet^8,11. Dessutom introducerar vi en tvåstegs fixeringsmetod, med mild fixering perfusion som gör det möjligt att använda samma hjärna både för immunofluorescensstudier med lätt mikroskopi och SBEM.

I protokollet är en mushjärna främst fixerad med ett milt fixativ och skärs sedan i halvor, och en halvklot postfixeras och förbereds för immunofluorescens (IF), medan den andra för EM-studier (Figur 1).

Figur 1. Schematisk representation av arbetsflödet för dendritiska ryggraden förberedelse för analysen med SBEM. Möss offrades och perfused med en mild primära fixativ. Hjärnan var skuren i halvor, och en halvklot postfixerades med immunofluorescens (IF)-dedikerade fixativ, cryoprotected, skivas med en cryostat och bearbetades för IF studier, medan den andra halvklotet var postfixed med EM fixativ, skivas med vibratome och beredd för EM studier. Hjärnskivor för SBEM-studier kontrasterades, platt inbäddad i harts, sedan monterades en CA1-region i hippocampus på stiftet och avbildades med SBEM (Figur 1). Den del av protokollet som markerats i en gul ruta presenterades i videon. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.