Большинство возбуждающих синапсов в центральной нервной системе расположены на дендритных шипах – небольших выступах мембраны нейрона. Эти протрузии образуют замкнутые биохимические компартменты, которые контролируют внутриклеточную трансдукцию сигнала. Структурная пластичность дендритных шипов и синапсов тесно связана с функциональными изменениями синаптической эффективности, лежащими в основе таких важных процессов, как обучение и память^1,2. Важно отметить, что электронная микроскопия (ЭМ) является единственным методом, позволяющим определить, имеет ли дендритный позвоночник пресинаптический вход. Разрешение ЭМ также необходимо для изучения ультраструктурных деталей, таких как форма постсинаптической плотности (PSD), представляющая собой постсинаптическую часть синапса, или размеры дендритного позвоночника, а также размер и форма аксонального бутона. Кроме того, с помощью ЭМ можно визуализировать синапсы и их окружение.

Благодаря достижениям в области визуализации и вычислительных технологий можно реконструировать целые нейронные цепи. Методы объемной электронной микроскопии, такие как просвечивающая электронная микроскопия с последовательным сечением (ssTEM), последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBEM) и сфокусированная ионно-лучевая сканирующая электронная микроскопия (FIB-SEM), обычно используются для реконструкций нейронных^{цепей 3.}

В наших исследованиях метод SBEM успешно используется для исследования структурной пластичности дендритных шипов и PSD в образцах гиппокампа мыши и органотипических срезов мозга ^4,5. SBEM основан на установке миниатюрного ультрамикротома внутри камеры сканирующего электронного микроскопа^6,7,8,9. Верхняя часть блока образца визуалируется, а затем образец разрезается на заданную глубину ультрамикротомом, выявляя новую грань блока, которая снова визуализирована, а затем процесс повторяется^8. В результате остается только изображение грани блока, в то время как вырезанный срез теряется в виде обломков. Вот почему SBEM называют деструктивной техникой, что означает, что невозможно снова изобразить одно и то же место. Однако преимущество деструктивных методов on-block заключается в том, что они не страдают от проблем деформации и потери секций, что может существенно повлиять на качество данных и анализ данных^3. Кроме того, SBEM дает возможность изображения относительно большого поля зрения (> 0,5 мм × 0,5 мм) при высоком разрешении^3.

Чтобы использовать SBEM, образцы должны быть подготовлены в соответствии со специальным, высококонтрастным протоколом из-за обратно рассеянного электронного детектора, используемого для получения изображений. Здесь мы покажем, как выполнять пробоподготовку по протоколу, основанному на процедуре, разработанной Методом Deerinck¹⁰ (Метод Национального центра микроскопии и визуализации (NCMIR)), с использованием восстановленных пятен осмий-тиокарбогидразид-осмий (rOTO), разработанных в 1980-х^{годах8,11.} Кроме того, мы вводим двухэтапный подход фиксации, с мягкой фиксацией перфузии, что позволяет использовать один и тот же мозг как для иммунофлуоресцентных исследований с помощью световой микроскопии, так и SBEM.

В протоколе мозг мыши в первую очередь фиксируется мягким фиксатором, а затем разрезается на половинки, а одно полушарие постфиксируется и готовится к иммунофлуоресценции (ИФ), а другое для ЭМ-исследований(Рисунок 1).

Рисунок 1. Схематическое представление рабочего процесса подготовки дендритных шипов к анализу с помощью SBEM. Мышей приносили в жертву и перфузировали мягким первичным фиксатором. Мозг разрезали на половинки, и одно полушарие было постфиксировано иммунофлуоресцентным (IF) фиксатором, криопротекционировано, разрезано с использованием криостата и обработано для исследований ПЧ, в то время как другое полушарие было постфиксировано ЭМ-фиксатором, разрезано вибратомом и подготовлено для эм-исследований. Срезы мозга для исследований SBEM были противопоставлены, плоско встроены в смолу, затем область CA1 гиппокампа была установлена на штифт и изображена с помощью SBEM(рисунок 1). Часть протокола, выделенная в желтом поле, была показана в видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.