A maioria das sinapses excitatórias no sistema nervoso central estão localizadas em espinhas dendríticas – pequenas saliências de uma membrana neuronal. Essas saliências formam compartimentos bioquímicos confinados que controlam a transdução de sinal intracelular. A plasticidade estrutural das espinhas e sinapses dendríticas está intimamente relacionada com as mudanças funcionais na eficácia sináptica que fundamentam processos tão importantes como a aprendizagem e a memória^1,2. É importante notar que a microscopia eletrônica (EM) é a única técnica que permite determinar se uma coluna dendrítica tem uma entrada pré-sináptica. A resolução EM também é necessária para estudar detalhes ultraestruturais, como a forma de uma densidade postiáspática (PSD), representando uma parte postsiáspática de uma sinapse, ou dimensões de uma coluna dendrítica, bem como o tamanho e a forma de um bouton axonal. Além disso, com o EM é possível visualizar sinapses e seus arredores.

Graças aos avanços nas tecnologias de imagem e computação é possível reconstruir circuitos neurais inteiros. Técnicas de microscopia eletrônica de volume, como microscopia eletrônica de transmissão de seção serial (ssTEM), microscopia eletrônica de varredura de rosto serial (SBEM) e microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons (FIB-SEM) são comumente utilizadas para reconstruções de circuito neuronal³.

Em nossos estudos, o método SBEM é empregado com sucesso para investigar a plasticidade estrutural de espinhos dendráticos e PSDs em amostras do hipocampo do camundongo e das fatias cerebrais organotípicas ^4,5. O SBEM é baseado na instalação de um ultramicromo em miniatura dentro da câmara de microscópio eletrônico de varredura^6,7,8,9. A parte superior do bloco de amostra é imageda e, em seguida, a amostra é cortada a uma profundidade especificada pelo ultramicrotome, revelando um novo bloco-face, que é novamente imagedo e, em seguida, o processo é repetido⁸. Como resultado, apenas a imagem de um rosto de bloco é deixada enquanto a fatia que foi cortada é perdida como detritos. É por isso que o SBEM é chamado de técnica destrutiva, o que significa que não é possível imaginar o mesmo lugar novamente. No entanto, a vantagem dos métodos destrutivos no bloco é que eles não sofrem de problemas de deformação e perda de seção que podem afetar significativamente a qualidade dos dados e a análise de dados³. Além disso, a SBEM dá a possibilidade de imagem de um campo de visão relativamente grande (> 0,5 mm × 0,5 mm) em alta resolução³.

Para empregar o SBEM, as amostras devem ser preparadas de acordo com um protocolo dedicado e altamente contrastante devido ao detector de elétrons backscattered usado para a aquisição de imagens. Mostramos aqui como realizar a preparação da amostra de acordo com o protocolo baseado em um procedimento desenvolvido pelo Deerinck¹⁰ (Centro Nacional de Pesquisa em Microscopia e Imagem (NCMIR), utilizando manchas reduzidas de osmium-thiocarbohydrazida-osmium (rOTO) desenvolvidas na década de 1980^8,11. Além disso, introduzimos uma abordagem de fixação em duas etapas, com perfusão de fixação leve que permite usar o mesmo cérebro tanto para estudos de imunofluorescência com microscopia leve e SBEM.

No protocolo, um cérebro de camundongo é fixado principalmente com um fixador leve, e depois cortado em metades, e um hemisfério é postfixado e preparado para imunofluorescência (IF), enquanto o outro para estudos EM(Figura 1).

Figura 1. Representação esquemática do fluxo de trabalho para a preparação das lombadas dendríticas para a análise com a SBEM. Os ratos foram sacrificados e perfundidos com um leve fixador primário. O cérebro foi cortado em metades, e um hemisfério foi postfixado com imunofluorescência (IF) dedicada fixação, crioprotegida, fatiada usando um criostat e processada para estudos if, enquanto o outro hemisfério foi postfixado com FIXAtivo EM, fatiado com o vibratome e preparado para estudos EM. As fatias cerebrais para estudos da SBEM foram contrastadas, planas embutidas em resina, em seguida, uma região ca1 do hipocampo foi montada ao pino, e imageada com SBEM (Figura 1). A parte do protocolo destacada em uma caixa amarela foi destaque no vídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.