中枢神経系の興奮シナプスのほとんどは樹状脊椎に位置しています – 神経膜の小さな突起。これらの突起は、細胞内シグナル伝達を制御する限定された生化学的コンパートメントを形成する。樹状脊椎およびシナプスの構造的可塑性は、学習^{および記憶1、2}のような重要なプロセスの根源となるシナプス有効性の機能的変化と密接に関連している。電子顕微鏡(EM)は、樹状脊椎にシナプス前入力があるかどうかを判断できる唯一の技術であることに注意することが重要です。EM解像度は、シナプス後の部分(PSD)、シナプス後の部分、樹状脊椎の寸法、軸索の大きさと形状などの超構造的な詳細を研究するためにも必要です。さらに、EMを使用すると、シナプスとその周辺を視覚化することが可能です。

イメージングおよびコンピューティング技術の進歩により、神経回路全体を再構築することが可能です。体積電子顕微鏡法は、例えば、シリアルセクション透過電子顕微鏡(ssTEM)、シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBEM)、および集光イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)などの神経回路再構成に一般的に用い^{られている。}

我々の研究では、SBEM法は、マウス海馬および組織性脳スライス^4,5のサンプルにおける樹状脊椎およびPSDの構造的可塑性を調査するためにうまく採用されている。SBEMは、走査型電子顕微鏡室^{6、7、8、9}の中にミニチュアの超ミクロトームを設置することに基づいています。サンプルブロックの上部が画像化され、その後、サンプルがウルトラミクロトームによって指定された深さで切断され、新しいブロック面が明らかに^{なります。}その結果、切断されたスライスが破片として失われている間、ブロック面の画像のみが残されます。SBEMが破壊的な技術と呼ばれる理由は、同じ場所を再びイメージすることはできません。しかし、破壊的なオンブロック法の利点は、データ品質とデータ分析³に大きな影響を与える可能性のある歪み問題やセクション損失に苦しんでいないということです。さらに、SBEMは、比較的大きな視野(>0.5mm×0.5mm)を高解像度³で画像化する可能性を与える。

SBEMを採用するには、画像の取得に使用される反射電子検出器により、サンプルを専用の非常にコントラストの高いプロトコルに従って調製する必要があります。ここでは、1980年代^8,11年に開発された還元オスミウムチオカルボヒドラジド(rOTO)染色を用いて、Deerinck¹⁰⁽国立顕微鏡・イメージング研究センター(NCMIR)法)が開発した手順に基づいて、プロトコルに従ってサンプル調製を行う方法を示す。また、軽顕微鏡とSBEMによる免疫蛍光研究に同じ脳を用いることができる軽度の固定灌流を用いて、2段階固定法を導入する。

プロトコルでは、マウスの脳は主に軽度の固定剤で固定され、次いで半分に切断され、一方の半球は後固定され、免疫蛍光(IF)のために準備され、もう1つはEM研究のために(図1)である。

図 1.SBEM を使用した解析のための樹状脊椎の準備のためのワークフローの概略表現。 マウスを屠殺し、軽度の一次固定剤を浸透させた。脳は半分に切断され、1つの半球は免疫蛍光(IF)専用の固定剤(IF)専用の固定剤で後固定され、凍結保護され、凍結スタットを使用してスライスされ、IF研究のために処理され、他の半球はEM固定剤で後付けされ、ビブラートでスライスされ、EM研究のために準備された。SBEM研究のための脳スライスは対照的であり、樹脂に平らに埋め込まれ、次いで海馬のCA1領域をピンに取り付け、SBEMで画像化した(図1)。黄色いボックスで強調表示されたプロトコルの一部は、ビデオで紹介されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。