מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים
Summary
מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתית (SBEM) מוחלת על תמונה ולנתח קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס המורין.
Abstract
מיקרוסקופיית אלקטרונים תלת מימדית (3D EM) נותנת אפשרות לנתח פרמטרים מורפולוגיים של קוצים דנדריטיים ברזולוציה ננומטרית. בנוסף, תכונות מסוימות של קוצים דנדריטיים, כגון נפח עמוד השדרה וצפיפות פוסט-סינפטית (PSD) (המייצגת חלק פוסט-סינפטי של הסינפסה), נוכחות של מסוף פרזינפטי, ורטיקולום אנדופלסמי חלק או צורה לא טיפוסית של PSD (למשל, עמוד שדרה מרובה פנימיות), ניתן לראות רק עם 3D EM. על ידי שימוש במיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פני בלוק (SBEM) ניתן להשיג נתונים אלקטרומגם תלת-ממדיים בקלות ובאופן רב יותר מאשר בעת ביצוע חתך סדרתי מסורתי. כאן אנו מראים כיצד להכין דגימות היפוקמפוס עכבר לניתוח SBEM וכיצד פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם מחקר חיסוני של קוצים דנדריטיים. זלוף קיבעון מתון מאפשר לנו לבצע מחקרים אימונופלואורסצנטיים עם מיקרוסקופיה קלה על מחצית אחת של המוח, בעוד החצי השני היה מוכן SBEM. גישה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים שישמשו למחקר.
Introduction
רוב הסינפסות המרגשות במערכת העצבים המרכזית ממוקמות על קוצים דנדריטיים – בליטות קטנות של קרום עצבי. בליטות אלה יוצרות תאים ביוכימיים מוגבלים השולטים בהעברת אותות תאיים. פלסטיות מבנית של קוצים וסינפסות דנדריטיים קשורה קשר הדוק לשינויים התפקודיים ביעילות הסינפטית העומדים בבסיס תהליכים חשובים כגון למידה וזיכרון1,2. חשוב לציין כי מיקרוסקופיה אלקטרונים (EM) היא הטכניקה היחידה המאפשרת לקבוע אם עמוד השדרה דנדריטי יש קלט presynaptic. רזולוציית EM נדרשת גם כדי ללמוד פרטים אולטרה-מבניים כגון צורה של צפיפות פוסט-סינפטית (PSD), המייצגת חלק פוסט-סינפטי של סינפסה, או ממדים של עמוד שדרה דנדריטי, כמו גם את הגודל והצורה של בוטון אקסוני. בנוסף, עם EM ניתן לדמיין סינפסות וסביבתם.
הודות להתקדמות בטכנולוגיות הדמיה ומחשוב ניתן לשחזר מעגלים עצביים שלמים. טכניקות מיקרוסקופיה אלקטרונים נפח, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור מקטע סדרתי (ssTEM), מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת פני בלוק סדרתית (SBEM) ומיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) משמשות בדרך כלל לשחזורים של מעגלים עצביים3.
במחקרים שלנו, שיטת SBEM משמש בהצלחה כדי לחקור את הפלסטיות המבנית של קוצים דנדריטיים ו- PSD בדגימות של היפוקמפוס העכבר ופרוסות מוח אורגנוטיפיות 4,5. ה- SBEM מבוסס על התקנת אולטרה-מיקרודום מיניאטורי בתוך תא מיקרוסקופ האלקטרונים סורק6,7,8,9. החלק העליון של בלוק המדגם הוא בתמונה, ולאחר מכן המדגם נחתך בעומק שצוין על ידי ultramicrotome, חושף פרצוף בלוק חדש, אשר שוב בתמונה ולאחר מכן התהליך חוזר עלעצמו 8. כתוצאה מכך, רק התמונה של פרצוף בלוק נותרת בעוד הפרוסה שנחתכה אבדה כשרידים. לכן SBEM נקרא טכניקה הרסנית, כלומר לא ניתן לדמיין את אותו המקום שוב. עם זאת, היתרון של שיטות חסימה הרסניות הוא שהם אינם סובלים מבעיות עיוות ואובדן מקטע שיכול להשפיע באופן משמעותי על איכות הנתונים וניתוח הנתונים3. יתר על כן, SBEM נותן את האפשרות לדמיין שדה ראייה גדול יחסית ( > 0.5 מ”מ × 0.5 מ”מ) ברזולוציה גבוהה3.
כדי להעסיק SBEM, דגימות צריכות להיות מוכנות על פי פרוטוקול ייעודי, מנוגד מאוד בשל גלאי אלקטרונים backscattered המשמש לרכישת תמונות. אנו מראים כאן כיצד לבצע הכנת מדגם על פי הפרוטוקול המבוסס על הליך שפותח על ידי Deerinck10 (המרכז הלאומי למיקרוסקופיה ומחקר הדמיה (NCMIR), באמצעות כתמי אוסמיום-thiocarbohydrazide-osmium מופחתים שפותחו בשנות השמונים8,11. בנוסף, אנו מציגים גישת קיבעון דו-שלבית, עם זלוף קיבעון מתון המאפשר להשתמש באותו מוח הן למחקרי אימונופלואורסצנטיות עם מיקרוסקופיה קלה ו- SBEM.
בפרוטוקול מוח עכבר קבוע בעיקר עם קיבעון קל, ולאחר מכן חתוך לחצי, וחצי כדור אחד הוא postfixed ומוכן עבור אימונופלואורסצנטיות (IF), בעוד השני למחקרי EM (איור 1).
איור 1. ייצוג סכמטי של זרימת העבודה עבור הכנת קוצים דנדריטי לניתוח עם SBEM. עכברים הוקרבו ונושלו עם קיבעון ראשוני מתון. המוח נחתך לחצי, וחצי הכדור השני הוצב עם קיבוע חיסוני (IF) קיבעוני ייעודי, קריו-מוגן, פרוס באמצעות קריוסטט ומעובד למחקרי IF, בעוד חצי הכדור השני היה postfixed עם מתקן EM, פרוס עם הוויברטום והוכן למחקרי EM. פרוסות המוח למחקרי SBEM היו מנוגדות, שטוח מוטבע שרף, אז אזור CA1 של ההיפוקמפוס הותקן על הסיכה, ותמונה עם SBEM (איור 1). החלק בפרוטוקול המודגש בקופסה צהובה הוצג בסרטון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן וריאציות רבות של שיטת NCMIR העיקרית המתוארת על ידי Deerinck בשנת 201010. העקרונות הבסיסיים נשארים זהים, אך בהתאם לסוג החומר הנלמד, מיושמים שינויים קלים. זה תואר בעבר כי שרפים שונים ניתן להשתמש כדי להטמיע דגימות עבור SBEM למשל במקרה של צמחים, Spurr של הוא שרף של בחירה בשל הצמיגות הנמוכה ש…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הדמיית SBEM, הדמיית מיקרוסקופיה קלה והכנת דגימת מיקרוסקופיה אלקטרונית בוצעו עם שימוש בציוד של המעבדה לרקמת הדמיה ותפקוד המשמשת כמתקן ליבה הדמיה במכון ננקי לביולוגיה ניסויית.
להכנת איור 1 נעשה שימוש בתמונה של עכבר (Souris_02) ובבינה מבית https://smart.servier.com/.
עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המדע הלאומי (פולין) גרנט אופוס (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) שהוענק ל- KR.
Materials
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Fixatives: | |||
| Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
| Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade,  98%, pellets (anhydrous) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
| Perfusion: | |||
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
| Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
| Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
| Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
| Brain slices preparation for EM: | |||
| 12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
| Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
| Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
| Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
| Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
| Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
| Brain slices preparation for IF: | |||
| 96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
| Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
| Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
| Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
| Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
| Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
| Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
| Immunostaining: | |||
| 24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
| Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
| Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
| Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
| Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
| TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
| Electron microsocpy sample preparation | |||
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
| Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
| DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
| Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
| Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
| Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
| Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
| Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, 98% (HPLC) |
| Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% trace metals basis |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
| pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
| Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
| Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
| Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N) |
| Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
| Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
| Specimen mounting for SBEM | |||
| 96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
| AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
50-001521 | |
| Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
| Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
| Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
10-006003 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
| Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
| Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
| Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
| trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
| Software | webpage | tutorials | |
| FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
| Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
| Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
| Animals | |||
| Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |
Referenzen
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
- Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience. Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).
- Śliwińska, M. A., et al. Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII. Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).
- Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density. Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).
- Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Mercer, E. H. a scheme for section staining in electron microscopy. Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
- Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).
- Roels, J., et al. An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).
- Radwanska, K., et al. Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).
- Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
- Fendrych, M., et al. Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis. Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).
- Russell, M. R. G., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae). Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).
- Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).
- Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).
- Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella. Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).
- Starborg, T., et al. Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization. Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).
- Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).
- Bojko, A., et al. Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).
- Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).
- Glauert, A. M., Lewis, P. R. . Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).
- Genoud, C. Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice. Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).
