De fleste af de excitatoriske synapser i centralnervesystemet er placeret på dendritiske rygsøjler – små fremspring af en neuronal membran. Disse fremspring danner begrænsede biokemiske rum, der styrer intracellulær signaltransduktion. Strukturel plasticitet af dendritiske rygsøjler og synapser er tæt forbundet med de funktionelle ændringer i synaptisk effekt, der ligger til grund for så vigtige processer som læring og hukommelse^1,2. Det er vigtigt at bemærke, at elektronmikroskopi (EM) er den eneste teknik, der gør det muligt at afgøre, om en dendritisk rygsøjle har et præsynaptisk input. EM-opløsning er også nødvendig for at studere ultrastrukturelle detaljer såsom form af en postsynaptisk tæthed (PSD), der repræsenterer en postsynaptisk del af en synapse, eller dimensioner af en dendritisk rygsøjle, samt størrelsen og formen af en axonal bouton. Derudover er det med EM muligt at visualisere synapser og deres omgivelser.

Takket være fremskridt inden for billed- og computerteknologier er det muligt at rekonstruere hele neurale kredsløb. Volumenelektronmikroskopiteknikker, såsom seriel sektionstransmissionselektronmikroskopi (ssTEM), seriel blok-ansigtsscanning elektronmikroskopi (SBEM) og fokuseret ionstrålescanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) er almindeligt anvendt til neuronale kredsløbsrekonstruktioner³.

I vores undersøgelser anvendes SBEM-metoden med succes til at undersøge den strukturelle plasticitet af dendritiske rygsøjler og PSD’er i prøver af musen hippocampus og organotypiske hjerneskiver ^4,5. SBEM er baseret på installation af en miniature ultramikromitomi inde i scanningselektronmikroskopkammeret^6,7,8,9. Toppen af prøveblokken afbildes, og derefter skæres prøven i en bestemt dybde af ultramikrotomen og afslører en ny blokflade, som igen afbildes, og derefter gentages processen⁸. Som følge heraf er det kun billedet af en blok-ansigt er tilbage, mens skiven, der er blevet skåret er tabt som snavs. Derfor kaldes SBEM en destruktiv teknik, hvilket betyder, at det ikke er muligt at afbilde det samme sted igen. Fordelen ved de destruktive on-block-metoder er imidlertid, at de ikke lider af vridningsproblemer og sektionstab, der kan påvirke datakvaliteten og dataanalysen³betydeligt . Desuden giver SBEM mulighed for at afbilde et relativt stort synsfelt ( > 0,5 mm × 0,5 mm) ved høj opløsning³.

For at anvende SBEM skal prøverne forberedes i henhold til en dedikeret, meget kontrasterende protokol på grund af den backscattered elektrondetektor, der bruges til at erhverve billeder. Vi viser her, hvordan man udfører prøveforberedelse i henhold til protokollen baseret på en procedure udviklet af Deerinck¹⁰ (National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR) metode), ved hjælp af reducerede osmium-thiocarbohydrazide-osmium (rOTO) pletter udviklet i 1980’erne^8,11. Derudover introducerer vi en to-trins fikseringsmetode med mild fikseringsperfusion, der gør det muligt at bruge den samme hjerne både til immunfluorescensundersøgelser med lysmikroskopi og SBEM.

I protokollen er en musehjerne primært fastgjort med et mildt fikseringsmiddel og skæres derefter i halve, og den ene halvkugle anbringes og forberedes til immunfluorescens (IF), mens den anden til EM-undersøgelser (Figur 1).

Figur 1. Skematisk repræsentation af arbejdsprocessen for forberedelsen af dendritiske rygsøjler til analysen med SBEM. Mus blev ofret og perfunderet med en mild primær fikseringsmiddel. Hjernen blev skåret i halve, og en halvkugle blev anbragt med immunfluorescens (IF)-dedikeret fiksativ, kryobeskyttet, skåret ved hjælp af en kryostat og behandlet for IF-undersøgelser, mens den anden halvkugle blev anbragt med EM fiksativ, skåret med vibratomet og forberedt til EM-undersøgelser. Hjerneskiver til SBEM-undersøgelser blev kontrasteret, fladt indlejret i harpiks, så blev en CA1-region af hippocampus monteret på stiften og afbildet med SBEM (Figur 1). Den del af protokollen, der er fremhævet i en gul boks, blev vist i videoen. Klik her for at se en større version af dette tal.