Summary

Rilevazione dell'anticorpo sars-CoV-2 Receptor-Binding Domain utilizzando un bioreporter basato su HiBiT

Published: August 12, 2021
doi:

Summary

Il protocollo delineato descrive la procedura per la produzione del complesso proteico del dominio legante il recettore HiBiT e la sua applicazione per il rilevamento rapido e sensibile degli anticorpi SARS-CoV-2.

Abstract

L’emergere della pandemia di COVID-19 ha aumentato la necessità di migliori metodi di rilevamento sierologico per determinare l’impatto epidemiologico della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Il crescente numero di infezioni da SARS-CoV-2 solleva la necessità di migliori test di rilevamento degli anticorpi. Gli attuali metodi di rilevamento degli anticorpi compromettono la sensibilità per la velocità o sono sensibili ma richiedono molto tempo. Una grande percentuale di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 prende di mira il dominio di legame del recettore (RBD), uno dei compartimenti immunogenici primari di SARS-CoV-2. Recentemente abbiamo progettato e sviluppato un RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) altamente sensibile e bioluminescente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2. Il testo seguente descrive la procedura per produrre il complesso HiBiT-RBD e un test rapido per valutare la presenza di anticorpi mirati alla RBD utilizzando questo strumento. A causa della durata del prodotto proteico HiBiT-RBD su un’ampia gamma di temperature e della procedura sperimentale più breve che può essere completata entro 1 ora, il protocollo può essere considerato un’alternativa più efficiente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2 nei campioni di siero dei pazienti.

Introduction

La recente comparsa di un nuovo coronavirus, SARS-CoV21, ha causato oltre 2.800.000 morti e 128 milioni di infezioni al 30 marzo 20212. A causa della mancanza di una procedura di trattamento affidabile e consolidata per le terapie cliniche SARS-CoV-2, sono stati fatti molti sforzi per limitare l’ulteriore trasmissione virale e, cosa più importante, per sviluppare un trattamento efficace e robusto o un vaccino3. Ad oggi, ci sono più di 50 candidati vaccini COVID-19 in studi segnalati dall’Organizzazione Mondiale della Sanità4. Il rilevamento di anticorpi contro SARS-CoV-2 è di fondamentale importanza per determinare la stabilità a lungo termine della risposta umorale alla somministrazione del vaccino e nei pazienti guariti di COVID-195. Alcuni studi hanno dimostrato che esiste la possibilità che i pazienti con SARS-CoV-2 recuperati perdano la maggior parte degli anticorpi che legano RBD dopo 1 anno5,6,7,8,9. Sono necessarie ulteriori indagini per comprendere meglio l’immunità duratura e piattaforme di rilevamento degli anticorpi più sensibili possono aiutare ulteriormente tale lavoro. Anche le segnalazioni di immunità sostenuta di infezioni lievi da SARS-CoV-2, che suggeriscono risposte anticorpali a lungo termine, sono un’area di studio interessante e utile. Un metodo di rilevamento rapido e accurato è essenziale per il monitoraggio degli anticorpi nei sieri degli individui per fornire maggiori informazioni sull’immunità nella popolazione.

Come altri coronavirus, SARS-CoV-2 utilizza la glicoproteina spike sporgente per legarsi all’enzima-2 di conversione dell’angiotensina (ACE2) per avviare una cascata di eventi che portano alla fusione delle membrane virali e cellulari6,7. Diversi studi hanno recentemente dimostrato che l’RBD della proteina Spike ha un ruolo cruciale nell’suscitare una risposta anticorpale potente e specifica contro SARS-CoV28,9,10,11. In particolare, le correlazioni osservate da Premkumar et al. tra il titolo dell’anticorpo legante RBD e la potenza di neutralizzazione sars-CoV-2 del plasma dei pazienti sono coerenti con RBD come compartimento immunogenico della struttura del virus9. Con questo in mente, molti test diagnostici disponibili per il rilevamento degli anticorpi SARS-CoV-2 richiedono tempo e costi, richiedono una lunga procedura di incubazione e lavaggio (saggio immunoassorbente enzimatico [ELISA]) o mancano di sensibilità e accuratezza (saggio immunologico a flusso laterale [LFIA])12. Pertanto, un metodo sierologico complementare quantitativo e rapido di rilevamento degli anticorpi derivati da COVID-19 con elevata sensibilità, risposta rapida e costo relativamente basso servirebbe alla necessità di un test sierologico affidabile per la sorveglianza epidemiologica sars-CoV-2.

Collettivamente, i limiti degli attuali saggi sierologici hanno spinto lo studio del sistema di segnalazione bioluminescente come potenziale agente diagnostico in future indagini sierosoratorie. La bioluminescenza è una reazione enzima/substrato naturale, con emissione luminosa. La nanoluc luciferasi è la più piccola (19 kDa), ma il sistema più luminoso rispetto alla Renilla e alla lucciola luciferasi (36 kDa e 61 kDa, rispettivamente)13,14. Inoltre, Nanoluc ha il più alto rapporto segnale/rumore e stabilità tra i sistemi precedentemente menzionati. L’elevata intensità del segnale di Nanoluc supporta il rilevamento anche di quantità molto basse di fusioni di reporter15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) è una versione divisa del sistema Nanoluc, che è composto da due segmenti: piccolo BiT (11 amminoacidi; SmBiT) e BiT di grandi dimensioni (LgBiT) con interazioni di affinità relativamente bassa (KD = 190 μM ) per formare un complesso luminescente16. NanoBiT è ampiamente utilizzato in vari studi che coinvolgono l’identificazione delle interazioni proteina-proteina15,17,18,19 e delle vie di segnalazione cellulare11,20,21.

Recentemente, è stato introdotto un altro piccolo peptide con un’affinità nettamente superiore a LgBiT (KD = 0,7 nM ), vale a dire il sistema HiBiT Nano-Glo, al posto di SmBiT. L’alta affinità e il segnale forte del test Nano-Glo “add-mix-read” rendono HiBiT un tag peptidico adatto, quantitativo e luminescente. In questo approccio, il tag HiBiT viene aggiunto alla proteina bersaglio sviluppando un costrutto che impone interferenze strutturali minime. La fusione HiBiT-proteina si legherebbe attivamente alla controparte LgBiT, producendo un enzima luciferasi altamente attivo per generare bioluminescenza rilevabile in presenza di reagenti di rilevamento (Figura 1). Allo stesso modo, abbiamo sviluppato un sistema basato su HiBiT Nano-Glo per misurare prontamente il titolo anticorpale neutralizzante nei sieri di individui recuperati da SARS-CoV-2 e recentemente abbiamo sviluppato un RBD SARS-CoV-2 con tag HiBiT. Questo documento descrive il protocollo per la produzione del bioreporter HiBiT-RBD utilizzando procedure e apparecchiature di laboratorio standard e mostra come questo bioreporter può essere utilizzato in un test rapido ed efficiente per rilevare gli anticorpi mirati a SARS-CoV-2 RBD.

Protocol

NOTA: Il protocollo descritto di seguito aderisce a tutte le linee guida etiche secondo il codice di protocollo 20200371-01H. 1. Produzione e valutazione del bioreporter HiBiT-RBD Produrre una quantità sufficiente di bioreporter HiBiT-RBD Prepararsi per la coltura cellulare Preparare il mezzo Eagle modificato (DMEM) completo di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale e l’1% di penicillina/streptomicina. Quindi, riscaldare il supporto a bagnomaria a 37 °C.<…

Representative Results

I segnali provenienti sia dal lisato cellulare contenente HiBit-RBD che dal surnatante delle cellule trasfettate sono stati registrati (Figura 2) per valutare la fonte proteica appropriata. HiBiT-RBD e LgBit sono stati utilizzati separatamente come controlli e i dati hanno mostrato uno sfondo basso rispetto a un segnale forte quando entrambe le parti sono state combinate. Pertanto, l’interazione HiBiT-RBD con LgBiT è necessaria per generare un enzima attivo per la digestione del substrato e…

Discussion

Il crescente numero di persone infette da SARS-CoV-2 e lo sforzo in corso per la vaccinazione globale richiedono test sierologici sensibili e veloci che possono essere utilizzati in indagini sierologiche su larga scala. Recenti ricerche dimostrano che i bioreporter a base di nanoluciferasi split possono essere utilizzati per sviluppare tali saggi. Recentemente abbiamo sviluppato il bioreporter HiBiT-RBD per progettare un test che possa essere utilizzato per rilevare gli anticorpi specifici di SARS-CoV-2 nel siero del paz…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Apprezziamo e ringraziamo l’assistenza tecnica di Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin e Christiano Tanese De Souza. Ringraziamo anche Mina Ghahremani per il Graphic Design. Vorremmo anche ringraziare tutte le persone che hanno partecipato e donato i loro campioni di sangue per questo studio. DWC è supportato in parte dalla Facoltà di uOttawa e dal Dipartimento di Medicina.

Materials

5x Passive Lysis Buffer Promega E194A 30 mL
Bio-Plex Handheld Magnetic Washer Bio-Rad 171020100
DMEM Sigma D6429-500ml
Dual-Glo luciferase Assay System Promega E2940 100 mL kit
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F1051
HiBiT-RBD Plasmid gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA 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LgBiT Promega N3030
penicillin Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Pierce Protein G Magnetic Beads Thermo Fisher Scientific 88848
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent Signagen SL100688.5
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Synergy Mx Microplate Reader BioTek 96-well plate reader luminometer
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 2520056 0.25%

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Diesen Artikel zitieren
Rezaei, R., Surendran, A., Singaravelu, R., Jamieson, T. R., Taklifi, P., Poutou, J., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter. J. Vis. Exp. (174), e62488, doi:10.3791/62488 (2021).

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