このプロトコルは、同じラットのコホートを使用して 4 つの繰り返しを持つオブジェクトの場所タスクの詳細な手順を提供します。弱く、強いエンコーディングは、短期および長期の記憶を生成することができます。繰り返しプロトコルの柔軟性は、時間と労力を節約することによって外科手術を伴う研究のために有益であり得る。
オブジェクトプレイス認識は、げっ歯類の空間記憶を調べる際に使用される顕著な方法です。このオブジェクト配置認識メモリは、オブジェクトの場所タスクの基礎を形成します。この論文は、同じコホートを使用して最大4回の繰り返しを選択して、物体位置タスクの確立を導く広範なプロトコルを提供する。弱いエンコーディングプロトコルと強いエンコーディングプロトコルの両方を使用して、様々な強度の短期および長期の空間記憶を研究し、関連するメモリ阻害または強化操作の実装を可能にすることができます。さらに、ここで提示されたカウンターバランスを伴う試験の繰り返しにより、被験者内比較のための2つ以上のテストの結果を組み合わせてラット間の変動性を減らすことができます。この方法は、統計的な力を高めるのに役立ち、特に個々の行動に大きなばらつきをもたらす実験を実行する場合に強く推奨されます。これにより、各動物から得られたデータを増やし、必要な動物の総数を減らすことで、研究を直接洗練します。最後に、反復的な対象位置タスクの実施は、時間と労力を節約することによって外科的処置を伴う研究の効率を高める。
自然認識タスク(例えば、物体認識、物体位置認識)は、げっ歯類における記憶の調査において大いに利用されてきた。これらのテストは、恐怖のコンディショニングまたは報酬動機に基づく記憶を評価するために使用される様々なテストとは異なり、自発的認識タスクは新しい刺激に対する自発的な探索行動のみに基づいているという点で。この挙動は「ネオティック嗜好」1と呼ばれ、げっ歯類だけでなく、他の哺乳類種や鳥類や魚類などの哺乳類以外の動物類に内在する2。空間空間記憶に依存するオブジェクトプレイス認識は、オブジェクト位置タスク(空間オブジェクト認識タスクとも呼ばれます)3を使用して観察できます。病変の研究は、物体の場所認識が無傷の海馬4、5を必要とすることを示している。比較的単純なトレーニングプロトコルと補強の欠如のために、このタスクは、多くの研究で好ましいです。正と負の両方の補強の欠如は、行動を駆動する可能性のある追加のパラメータと脳領域を最小限に抑えます。したがって、ここでの動作は中立的であり、好奇心と空間記憶に基づいており、空間記憶のエンコード、統合、および検索に関与するメカニズムの調査が可能になります。
オブジェクトの場所のタスクのプロトコルは、通常、習慣化セッションと、エンコードとテストの試行の単一セッションで構成され、遅延期間で区切られ、数分から数時間に変化します。ラットは、動物のストレスレベルを最小限に抑えるために事前に取り扱うことを強くお勧めします, したがって、認識記憶に影響を与える可能性のある行動, 例えば、新規性に対する嫌悪感.同様に、適切に設計された習慣性プロトコルは、タスク中にラットの自然な行動を妨げる可能性のあるストレスを防ぐ上で不可欠な役割を果たします。しかし、取り扱いと習慣の程度は、実験室と実験者の間で大きく異なり、複製性が低い6、7、8に寄与する可能性がある。エンコードトライアルでは、ラットは2つの指定されたコーナーに位置する2つの同一のオブジェクトを持つアリーナを探索する時間を与えられます。期間遅れるテストトライアルでは、ラットは同じペアのオブジェクトでアリーナを探索する時間が与えられますが、今回はそれらの1つが新しい場所に移動されました。ラットが示した自発的な嗜好と、その結果、新しい場所での被オブジェクトの探索に費やされる時間の増加は、空間認識と物体位置の記憶を示す。エンコード試行の変更(繰り返しの持続時間と回数)は、メモリの強度に影響を与えます。
研究の目的に応じて、コード化と試験の間の遅延の長さは、タンパク合成に依存しない短期記憶またはタンパク合成依存性の長期記憶をモデル化するように変更することができる。したがって、必要に応じてプロトコルを適応させることによって、オブジェクトの位置タスクをさまざまな研究に使用できます。また、インビボイメージングと同様に、これらの試験の間には、薬理学的および光遺伝学的介入などの実験的操作の実施も可能である。同じラットコホート内のオブジェクト位置タスクの反復を報告する研究9,10がいくつかあります。これは、1匹の動物が繰り返しのない1つのセッションを持つ伝統的な使用とは対照的です。しかし、これらのパラダイムの有効性は十分に調査されておらず、また、これらを説明する方法文書もありません。私たちの知る限りでは、これは、同じラットコホートを使用して最大4回の繰り返しを持つオブジェクトの位置タスクを詳細に記述するプロトコルの最初の報告された説明であり、各繰り返しの結果を体系的に比較します。繰り返しは、実験条件のバランスを取り、テスト間の変動性を低減して被験者内比較を可能にするために使用できます。タスクの信頼性の高い繰り返しにより、データをプールすることができ、比較的少数のラットを使用して十分に大量のデータを生成することができます。最後に、同じラットを使用する繰り返しは、手術や移植を伴う実験において、必要なラットの数を減らすことで有益であり、その結果、時間と人件費を節約します。
この研究は、強いおよび弱いコード化試験を使用して成体ラットで物体位置タスクを実行し、その後1-hおよび24-hの遅延を伴う試験試験を行う方法を詳述する広範なプロトコルを提示する。強力な符号化プロトコルは、1-hおよび24-h遅延で試験された場合に統計的に有意な認識メモリを生成し、したがって、これらの記憶を阻害する操作の実施時に短期および長期記憶の両方を研究するために使用することができる11。一方、ウィークエンコーディングプロトコルは、1-h遅延でテストした場合に、有意な短期メモリのみを生成します。長期記憶の不在は、メモリ11、12の保持を強化するための操作を研究するために使用することができる。このプロトコルには、詳細な処理と習慣化セッションも含まれており、オブジェクトの場所タスクの複製性を高める目的で行われます。この論文はまた、弱い符号化プロトコルを使用してラットの同じコホートを持つ4つの異なる文脈におけるタスクの繰り返しを示し、毎回複製可能で一貫した結果を生み出すことが確認される。
オブジェクト位置タスクは、前述のように空間メモリを調査するためにさまざまなスタディで使用できます。セットアップの柔軟性により、異なる強みの短期記憶と長期記憶のモデリングが可能となり、低コストで簡単に実装できます。しかし、プロトコルには結果に影響を与えるパラメータが多数あり、これらのパラメータ6では異なるスタディが多少異なるため、初めてタスクをうまく実装することが困難になる可能性があります。上記のプロトコルは、読者がこのプロセスをスムーズに進める方法を意図しています。レプリカ性の高いタスクの実装を成功させる上で重要なステップを以下に説明します。
エンコーディング/テストセッションは、多くの場合、オブジェクトの位置実験を実行する際に焦点であるが、処理と習慣化プロトコルは、結果が乱れのない自然ラットの行動14、15に依存する行動テストのこれらの種類の結果に大きな影響を与える。そのため、エンコード/テスト セッションの前の手順は、ラットの動作やメモリに影響を与え、結果として最終的な結果に影響を与える可能性があるため、慎重に設計する必要があります。ラットが実験者に精通し、タスクが自然な行動を示す可能性を高めながらストレス要因の影響を最小限に抑えるような取り扱いと習慣の良いレベル8.プロトコルで述べたように、ラット株が家庭施設で維持されている場合、取り扱いは子犬の引き分けと同じくらい早く始めることができます。以前の経験(データは示されていません)に基づいて、いくつかの以前の研究16、17から、この早期の取り扱いは、その後の数ヶ月で低い不安と強化された好奇心をもたらします。
オブジェクトの位置タスクはラットの本質的な探索的ドライブのみに依存するので、ラットが探索することを熱望していない場合、または「ネオフォビック行動」1と呼ばれる新規性に近づくことを嫌がらない場合、期待される行動は容易に妨げられる可能性がある。そのため、研究の特定のニーズに応じて徹底的な取り扱いと習慣性プロトコルを含めることが強く推奨されます。このプロトコルは、最小要件ガイドとして使用することができ、さらなるステップを実装することができます(例えば、研究が後の段階で注射を含める場合は、注射手順と特定の保持位置への慣性が必要です)。実験ラットの株と年齢は、他の2つの影響力のある要因であり、最適でない結果を避けるために実験を計画する前に考慮する必要があります。異なるラット株は、異なる行動およびベースライン不安レベル18、19、20を有することができ、したがって、プロトコルへの特異的な調整が使用される株に応じて必要とされ得る。
このプロトコルは、長いエバンス株を持つTh-Creトランスジェニックラットとうまく機能することが確認されています リスターフードド株と野生型リスターフードラットに4回裏切り。行動実験におけるラットの論理的に理想的な開始年齢は約12週間20ですが、株間変動性とタスクの具体的な要件を考慮する必要があります。また、研究に関心がある場合は開発ラットを使用することもできますが、プロトコルの調整が必要であり、ここではカバーされていません。しかし、特定の年齢のラットがこのタスクを正常に実行するために必要な認知機能を開発したかどうかを考慮することが重要です。これを調査している研究21 は、出生後38日目の思春期ラットだけが、成人ラットで観察されるように、新しい場所での物体の好みに反映された同心空間記憶を示したことを報告している。ここで紹介したプロトコルは、最初のエンコード/テストセッションの開始時に15〜16週齢のラットを使用して成功しました。以前は、同じ強力な符号化プロトコルは、十分な年齢での取り扱いと習慣の欠如のために最適なレベルの習慣に達していなかった23週齢のラットを使用する場合、否定的な結果に最適ではない生成しました。これらのラットは、偶然レベルとは異なるパフォーマンスを発揮できなかったか、実際には、変位した物体の代わりに安定した物体の好みの点で観察されるように、新規性に対する嫌悪感を示した(データは示されていない)。これらの結果は、取り扱い習慣の年齢とタイミングが習慣の有効性に影響を与え、その結果、テストにおける不安とネオフォビック行動の観察に寄与する可能性があることを示す証拠を提供する。
ここでは、2 つの異なるプロトコルを概略して、オブジェクトの場所タスクで強力なエンコードまたは弱いエンコードを保証します。これらのプロトコルの確立の間に、単一の長い試験(例えば、20 分のコード化)の間に5〜10分の探査の後に物体への関心が低下し、ラットは最終的に探索を停止することが観察された。これにより、オブジェクトの位置のメモリが弱くなります。短い休止期間(例えば、3 x 5分符号化)と符号化試験をインターリーブする符号化プロトコルは、これを克服し、試験全体を通して高い探査をもたらす。したがって、アクティブな探査時間とこれら2つのエンコーディングプロトコルの異なるレイアウトは、メモリの強度に影響を与え、これは20分エンコードプロトコルの後よりも3 x 5分エンコード後に強くなります。同様の結果は、単一の試験とインターリーブされた試験プロトコルでわずかに異なる期間を使用して達成することができ、研究とラット株のニーズに合わせて調整することができます。
部屋の中で外部の手がかりだけを持つプレーンな白いオープンフィールドを使用するプロトコルとは対照的に、ここで提示されるプロトコルは、学習に多くの時間を必要とする明確なコンテキストと迷路内の手がかりを持つアリーナを使用しています。したがって、エンコード試行の前にプロトコルにコンテキスト習慣化ステップを追加することをお勧めします。これにより、ラットはこのマップに関連してオブジェクトの位置をエンコードするだけで済むため、習慣化中に各コンテキストの空間マップを形成し、次のエンコード試行の期間を短縮することができます。さらに、コンテキストの習慣化により、ラットは3D空間的手がかりなど、各コンテキスト内の可能なあらゆる気晴らしに慣れ、エンコーディング/テストセッションにおけるオブジェクト探査以外の行動を最小限に抑えることができます。いくつかのレベル(すなわち、 広範囲のオブジェクト位置の組み合わせ(カウンタ)とオブジェクトの変位方向からなる徹底的なカウンターバランス方式の実装により、アリーナの角で光強度と壁の色/パターンの変動によって上昇する可能性のある不要な好みが最小限に抑えられます。
このタスクを繰り返す場合は、エンコード/テスト セッション間の複製性を高め、繰り返しの影響を最小限に抑えるため、いくつかの要因を考慮する必要があります。まず、異なるコンテキスト (エンコーディング/テスト セッションの繰り返し回数と同じ数) は、同じコンテキストを使用して繰り返しセッションを実行することによって発生する可能性のある空間メモリの蓄積を避けるように設計する必要があります。これを実現するために、異なる色とパターンの交換可能な壁を備えた装置が使用された(図1B,C)。壁に掛けられた明確な壁や3Dオブジェクト(おもちゃや小さな日常的なアイテム、プロトコルと図1Cを参照)は、ラットが文脈に関連してオブジェクトの位置を学ぶのに使用する可能性のある空間的な手がかりとランドマークです。テストで移動したオブジェクトのプリファレンスが得られない場合、コンテキストのこれらのパラメータ(壁面設計と空間的キュー)の変更が考慮されます。または、このプロトコルのように、四角形または円形のアリーナを、正方形のアリーナの代わりにオブジェクトの位置タスクに使用することもできます。円形のアリーナは、コーナーを有するアリーナでしばしば観察されるコーナーの好み22を排除すると報告されており、したがって、特に高い不安ラットまたはマウス株を扱う場合に有益であり得る。このプロトコルで 4 つの異なるコンテキストを作成する要件は四角形の形状で最も最適に機能しますが、いくつかの調整に従って円形のアリーナを機能させることができます。
第二に、各エンコード/テストセッション間の間隔は、ラットが毎回同じレベルの関心を保持するように決定する必要があり、繰り返しの密なスケジュールに起因する累積的な学習のリスクを回避する必要があります。通常、エンコードと試験の間の遅延時間の少なくとも2倍の間隔で十分であり、2回以上の繰り返しに対して長い間隔が好ましい。つまり、24時間テスト後の最低48時間間隔は1回または2回の繰り返しで十分ですが、4回の繰り返しには1週間間隔を使用することをお勧めします。 図 5 の結果と ANOVA を使用した比較が示すように、タスクを 4 回正常に繰り返すことができます。これに基づいて、確立されたプロトコルを使用して、最大4つの実験条件のバランスを取ることができます。実験グループの数は、異なるコンテキストでのエンコード/試行セッションの繰り返しの数を決定します。 図 5 の結果は、2 つの実験グループでプロトコルを使用する 1 つの可能な方法を表しています。グループは 2 つのセッションで相殺され、同じ条件が 2 つの追加セッションで繰り返されました (検証の目的で)。2 番目のカウンターバランス セッションのセットは、新しい条件のバランスを取るためにも使用できます。同様に、3つまたは4つの実験条件を、それぞれ3つまたは4つのカウンターバランスセッションを用いて比較することができる。
このような場合、コンテキストは、プロトコルで説明されている対照的な特性に対応するように設計する必要があります。カウンターバランス設計は、長期的な効果や損傷を残す可能性のある薬理学的介入などの追加の操作を使用する実験には適していない可能性があることに注意してください。テストの有効性と再現性を維持するために、実験をそれに応じて設計する必要があります。繰り返しテストのデータを表示し、いくつかの方法で分析できます (図 5を参照)。初期分析では、各コンテキストの実験グループを、1サンプルt-testを使用して偶然レベルと個別に比較して、重要な好みを決定することができます(図5B,D)。これは、データを簡単に理解するのに役立ちますが、グループの間接的な比較のみを保証します。したがって、2つ以上のグループを比較するには、2サンプルのt-検定(ペアまたはペアでない)またはANOVAを使用してデータを分析する必要があります。これは、単一のエンコード/テストセッション内のグループの被験者間比較 (図 4Aおよび図5B,D) または 2 つ (またはそれ以上) のカウンターバランスコンテキストからのグループの被験者内比較の形式で行うことができます (図 5C,E)。後者の方法は、特に、前述のように、動作のランダム性のために高い分散をもたらす、弱いメモリ条件を扱う場合に強く推奨されます。
カウンターバランスコンテキストを組み合わせることで、グループの動作を最小限のバリエーションで確実に視覚化するために必要なグループが大きくなります。カウンターバランス セッションで繰り返しプロトコルを使用すると、同じ統計的な能力を持つ単一のテストを使用して必要となる数の約 3 分の 1 にラットの数が減少することが期待できます。通常、カウンターバランスセッションの場合は7〜15ラット(合計)の範囲のサンプルサイズと、効果サイズとパワーの両方が0.8より大きい単一セッションに対して20〜50匹(1グループあたり10〜25匹)の範囲で十分である。必要な動物の数の減少と、このプロトコルを使用して各動物から得られる情報の増加は、研究を洗練し、研究における動物の倫理的使用の3R原則に役立ちます。このステップでは、強い記憶を伴わないランダムラットの挙動は、個々の強い好みが偶然より下と上の両方をもたらす可能性があることを覚えておいてください。個々のデータは慎重に解釈する必要があります。グループ内の個々のデータポイントの分布は、結果を解釈するための有益な情報にもなります。 図4 と 図5に示すように、メモリの強度によって分布が変化します。全体的に見て、ここで紹介するプロトコルは、短期および/または長期の空間記憶をモデル化する繰り返しでオブジェクトの位置タスクを簡単に実装できます。シンプルで柔軟なトレーニングプロトコルとさらなる操作を実装する可能性は、このタスクを一般的な選択肢にします。このプロトコルに対するこれらの変更により、メモリの取得、統合、リコールなどの特定のステップの調査が可能になります。
The authors have nothing to disclose.
アントニオス・アジミナス、ドロシー・ツ、キイチ・オハラ、デビッド・ベットの皆様に、洞察力に富んだご意見やご提案をお願い申し上げたいと思います。この研究はエラスムス+(G.BとL.N.に)によって支えられた。オーフス大学大学院健康研究科(K.H.へ)ノボノルディスク財団ヤングリザベーション賞2017(NNF17OC0026774)、ルンドベックフォンデン(DANDRITE-R248-2016-2518)、PROMEMO – デンマーク国立研究財団(DNRF133)が出資する卓越性センターである記憶タンパク質センター(T.T.へ)。
Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |