Questo protocollo fornisce passaggi dettagliati per un’attività di localizzazione dell’oggetto con quattro ripetizioni utilizzando la stessa coorte di ratti. Una codifica debole e forte può produrre memorie a breve e lungo termine. La flessibilità del protocollo con ripetizione può essere utile per gli studi che coinvolgono operazioni chirurgiche risparmiando tempo e lavoro.
Il riconoscimento del luogo dell’oggetto è un metodo importante utilizzato per studiare la memoria spaziale nei roditori. Questa memoria di riconoscimento del luogo dell’oggetto costituisce la base dell’attività di posizione dell’oggetto. Questo documento fornisce un ampio protocollo per guidare la creazione di un compito di localizzazione degli oggetti con l’opzione di un massimo di quattro ripetizioni utilizzando la stessa coorte di ratti. Sia i protocolli di codifica deboli che quelli forti possono essere utilizzati per studiare memorie spaziali a breve e lungo termine di diversa forza e per consentire l’implementazione di manipolazioni rilevanti che inibiscono o migliorano la memoria. Inoltre, la ripetizione del test con il controbilanciamento qui presentato consente la combinazione dei risultati di due o più test per il confronto all’interno del soggetto per ridurre la variabilità tra i ratti. Questo metodo aiuta ad aumentare la potenza statistica ed è fortemente raccomandato, in particolare quando si eseguono esperimenti che producono un’elevata variazione nel comportamento individuale. Questo affina direttamente lo studio aumentando i dati ottenuti da ciascun animale e riducendo il numero complessivo di animali necessari. Infine, l’implementazione del compito di localizzazione ripetuta dell’oggetto aumenta l’efficienza degli studi che coinvolgono procedure chirurgiche risparmiando tempo e manodopera.
I compiti di riconoscimento spontaneo(ad esempio, il riconoscimento degli oggetti, il riconoscimento del luogo degli oggetti) sono stati utilizzati in larga misura nello studio della memoria nei roditori. Questi test sono diversi dalla varietà di test utilizzati per valutare la memoria che si basano sul condizionamento della paura o sulla motivazione della ricompensa, in quanto i compiti di riconoscimento spontaneo si basano esclusivamente sul comportamento esplorativo spontaneo verso nuovi stimoli. Questo comportamento, indicato come “preferenza neotica” 1 , è inerente airoditoricosì come ad altre specie di mammiferi e ad alcuni non mammiferi come uccelli e pesci2. Il riconoscimento del luogo dell’oggetto, che dipende dalla memoria spaziale, può essere osservato utilizzando l’attività di localizzazione dell’oggetto (nota anche come attività di riconoscimento degli oggetti spaziali)3. Studi sulle lesioni hanno dimostrato che il riconoscimento del luogo dell’oggetto richiede un ippocampo intatto4,5. A causa del protocollo di allenamento relativamente semplice e dell’assenza di qualsiasi rinforzo, questo compito è preferibile in molti studi. L’assenza di rinforzi sia positivi che negativi riduce al minimo i parametri aggiuntivi e le regioni del cervello che potrebbero guidare il comportamento. Quindi, il comportamento qui è neutro e si basa sulla curiosità e sulla memoria spaziale, consentendo l’indagine dei meccanismi coinvolti nella codifica, nel consolidamento e nel recupero della memoria spaziale.
Il protocollo per l’attività di localizzazione degli oggetti consiste in genere in sessioni di assuefazione seguite da una singola sessione di prove di codifica e test, separate da un periodo di ritardo, che varia da diversi minuti a ore. Si raccomanda vivamente che i ratti siano maneggiati in anticipo per ridurre al minimo il livello di stress degli animali e, quindi, il comportamento che potrebbe influenzare la memoria di riconoscimento, come l’avversione verso la novità. Allo stesso modo, un protocollo di assuefazione ben progettato svolge un ruolo essenziale nella prevenzione dello stress che potrebbe ostacolare il comportamento naturale del ratto durante il compito. Tuttavia, l’entità della manipolazione e dell’assuefazione varia in gran parte tra laboratori e sperimentatori, il che può contribuire alla bassa replicabilità6,7,8. Nella prova di codifica, al ratto viene dato il tempo di esplorare un’arena con due oggetti identici situati in due angoli designati. Nella prova di prova, che viene ritardata di un periodo, al topo viene dato il tempo di esplorare l’arena con la stessa coppia di oggetti, ma questa volta uno di essi è stato spostato in una nuova posizione. La preferenza spontanea esibita dai ratti e il conseguente aumento del tempo trascorso ad esplorare l’oggetto nella nuova posizione sono indicativi del riconoscimento spaziale e della memoria delle posizioni dell’oggetto3. La modifica della prova di codifica (durata e numero di ripetizioni) influenza la forza della memoria.
A seconda dello scopo dello studio, la durata del ritardo tra la codifica e gli studi di prova può essere modificata per modellare la memoria a breve termine indipendente dalla sintesi proteica o la memoria a lungo termine dipendente dalla sintesi proteica. Pertanto, l’attività di localizzazione dell’oggetto può essere utilizzata per un’ampia varietà di studi adattando il protocollo in base alle esigenze. Inoltre, l’implementazione di manipolazioni sperimentali, come interventi farmacologici e optogenetici, sono anche possibili tra questi studi, così come l’imaging in vivo. Esistono diversi studi9,10 che riportano ripetute iterazioni del compito di localizzazione dell’oggetto all’interno della stessa coorte di ratti. Questo contrasta con l’uso tradizionale in cui un animale ha una sessione senza ripetizioni. Tuttavia, l’efficacia di questi paradigmi non è stata studiata a fondo, né ci sono documenti di metodo che li descrivano. Per quanto ne s knowledge, questa è la prima descrizione riportata di un protocollo che descrive in dettaglio un compito di localizzazione dell’oggetto con un massimo di quattro ripetizioni utilizzando la stessa coorte di ratti, che confronta sistematicamente anche i risultati di ogni ripetizione. Le ripetizioni possono essere utilizzate per controbilanciare le condizioni sperimentali per consentire il confronto all’interno del soggetto con una ridotta variabilità tra i test. La ripetizione affidabile dell’attività consente di mettere in comune i dati, il che significa che è possibile generare una quantità sufficientemente grande di dati utilizzando un numero relativamente piccolo di ratti. Infine, le ripetizioni che utilizzano lo stesso ratto possono essere utili in esperimenti che coinvolgono operazioni chirurgiche e impianti riducendo il numero di ratti richiesti che, di conseguenza, consente di risparmiare tempo e costi di manodopera.
Questo studio presenta un ampio protocollo che descrive in dettaglio come eseguire un compito di localizzazione dell’oggetto nei ratti adulti utilizzando prove di codifica forti e deboli seguite da prove di prova con ritardi di 1 ora e 24 ore. Il protocollo di codifica forte produce memoria di riconoscimento statisticamente significativa quando testato con ritardi di 1 ora e 24 ore e può quindi essere utilizzato per studiare sia le memorie a breve che a lungo termine dopo l’implementazione di manipolazioni per inibire questi ricordi11. Al contrario, il protocollo di codifica debole produce memoria significativa a breve termine solo se testato con un ritardo di 1 ora. L’assenza di memoria a lungo termine può essere utilizzata per studiare manipolazioni per migliorare la conservazione della memoria11,12. Questo protocollo include anche sessioni dettagliate di gestione e assuefazione, che mirano ad aumentare la replicabilità dell’attività di localizzazione dell’oggetto. Questo documento dimostra anche la ripetizione del compito in quattro contesti distinti con la stessa coorte di ratti utilizzando il protocollo di codifica debole, che è confermato per produrre risultati replicabili e coerenti ogni volta.
L’attività di localizzazione dell’oggetto può essere utilizzata in una varietà di studi per studiare la memoria spaziale come descritto in precedenza. La flessibilità della configurazione consente la modellazione di memorie a breve e lungo termine di diversi punti di forza e può essere facilmente implementata a basso costo. Tuttavia, poiché ci sono molti parametri nel protocollo che possono influenzare i risultati e diversi studi variano leggermente in questi parametri6, si potrebbero incontrare difficoltà nell’implementare con successo l’attività per la prima volta. Il protocollo di cui sopra ha lo scopo di guidare i lettori attraverso questo processo senza intoppi. Ulteriori passaggi cruciali che potrebbero essere significativi per il successo dell’implementazione dell’attività con elevata replicabilità saranno discussi di seguito.
Sebbene la sessione di codifica / test sia spesso al centro dell’attenzione durante l’esecuzione di esperimenti di localizzazione degli oggetti, i protocolli di manipolazione e assuefazione hanno un profondo effetto sull’esito di questo tipo di test comportamentali in cui il risultato dipende dal comportamento naturale indisturbato del ratto14,15. Pertanto, i passaggi che precedono la sessione di codifica / test devono essere progettati con cautela, in quanto possono influenzare il comportamento e la memoria dei ratti e, di conseguenza, influenzare i risultati finali. Un buon livello di manipolazione e assuefazione in modo tale che i ratti acquisiscano familiarità con lo sperimentatore e il compito ridurrà al minimo l’effetto dei fattori di stress aumentando al contempo la probabilità di esibire un comportamento naturale8. Come menzionato nel protocollo, la manipolazione può iniziare già dallo svezzamento dei cuccioli se il ceppo di ratto viene mantenuto nella struttura domestica. Sulla base dell’esperienza precedente (dati non mostrati) e da quella di diversi studi precedenti16,17,questa gestione precoce si traduce in bassa ansia e maggiore curiosità nei mesi successivi.
Poiché il compito di localizzazione dell’oggetto dipende esclusivamente dalla spinta esplorativa intrinseca dei ratti, il comportamento atteso può essere facilmente ostacolato se i ratti non sono desiderosi di esplorare o riluttanti ad avvicinarsi alla novità, che viene definita “comportamento neofobico”1. Pertanto, si consiglia vivamente di includere un protocollo di manipolazione e assuefazione approfondito in base alle esigenze specifiche dello studio. Questo protocollo può essere utilizzato come guida minima ai requisiti e possono essere implementati ulteriori passaggi(ad esempio,se lo studio deve includere iniezioni in una fase successiva, è necessaria l’assuefazione alle procedure di iniezione e la posizione di tenuta specifica). Il ceppo e l’età dei ratti sperimentali sono altri due fattori influenti e dovrebbero essere considerati prima di pianificare un esperimento per evitare risultati non ottimali. Diversi ceppi di ratto possono avere comportamenti diversi e livelli di ansia basale18,19,20 e, pertanto, può essere necessario un aggiustamento specifico al protocollo a seconda del ceppo utilizzato.
Questo protocollo ha confermato di funzionare bene con ratti transgenici Th-Cre con ceppo Long-Evans incrociato quattro volte al ceppo Lister Hooded e ai ratti Lister Hooded wild-type. Un’età di inizio logicamente ideale per i ratti negli esperimenti comportamentali è di circa 12 settimane20, ma la variabilità tra ceppi e i requisiti specifici del compito dovrebbero essere spiegati. Potrebbe anche essere possibile utilizzare ratti in via di sviluppo se è di interesse per lo studio, anche se potrebbero essere necessari adeguamenti al protocollo e non sono trattati qui. Tuttavia, è importante considerare se il ratto a una determinata età ha sviluppato le funzioni cognitive necessarie per svolgere con successo questo compito. Uno studio21 che indaga su questo ha riportato che solo i ratti adolescenti al giorno 38 postnatale e non prima, hanno mostrato una memoria spaziale allocentrica riflessa nella preferenza per l’oggetto nella nuova posizione, come osservato nei ratti adulti. Il protocollo qui presentato ha avuto successo utilizzando ratti che avevano 15-16 settimane all’inizio della prima sessione di codifica / test. In precedenza, lo stesso forte protocollo di codifica produceva risultati da subottimali a negativi quando si utilizzavano ratti di 23 settimane che non avevano raggiunto il livello ottimale di assuefazione a causa della mancanza di manipolazione e assuefazione a un’età abbastanza giovane. Questi ratti non sono riusciti a comportarsi in modo diverso dal livello casuale o, di fatto, hanno mostrato avversione verso la novità osservata in termini di preferenza per gli oggetti stabili anziché per gli oggetti spostati (dati non mostrati). Questi risultati forniscono la prova che l’età e i tempi dell’assuefazione di manipolazione possono avere un impatto sull’efficacia dell’assuefazione e, di conseguenza, contribuire all’osservazione del comportamento ansioso e neofobico nei test.
Qui vengono delineati due diversi protocolli, che garantiscono una codifica forte o debole nell’attività di localizzazione dell’oggetto. Durante l’istituzione di questi protocolli, è stato osservato che l’interesse per gli oggetti è diminuito dopo 5-10 minuti di esplorazione durante singole prove lunghe(ad esempio, codifica di 20 minuti) e i ratti alla fine hanno smesso di esplorare. Ciò si traduce in una memoria più debole delle posizioni degli oggetti. Un protocollo di codifica che interlascia le prove di codifica con brevi periodi di riposo(ad esempio, codifica 3 x 5 minuti) supera questo e porta a un’esplorazione elevata durante le prove. Pertanto, il tempo di esplorazione attivo e il diverso layout di questi due protocolli di codifica influenzano la forza della memoria, che è più forte dopo una codifica di 3 x 5 minuti rispetto a dopo i protocolli di codifica di 20 minuti. Risultati simili possono anche essere ottenuti utilizzando durate leggermente diverse con protocolli di prova singola rispetto a protocolli di prova interlacciati e possono essere apportate modifiche per soddisfare le esigenze dello studio e del ceppo di ratto.
A differenza dei protocolli che utilizzano un semplice campo aperto bianco con solo segnali esterni nella stanza, il protocollo presentato qui utilizza un’arena con contesti distinti e segnali intra-labirinto che probabilmente richiedono più tempo per imparare. Pertanto, si raccomanda l’aggiunta di una fase di assuefazione del contesto nel protocollo prima della prova di codifica. Ciò consentirà ai ratti di formare una mappa spaziale di ciascun contesto durante l’assuefazione e ridurre la durata della successiva prova di codifica, poiché i ratti dovranno solo codificare le posizioni degli oggetti in relazione a questa mappa. Inoltre, l’assuefazione del contesto consentirà ai ratti di abituarsi a qualsiasi possibile distrattore all’interno di ciascun contesto, come i segnali spaziali 3D, riducendo al minimo i comportamenti diversi dall’esplorazione degli oggetti nella sessione di codifica / test da seguire. Con l’implementazione di un metodo di controbilanciamento completo composto da diversi livelli(cioè una vasta gamma di combinazioni di posizione degli oggetti (contatori) e direzione dello spostamento dell’oggetto), le preferenze indesiderate che possono aumentare a causa delle variazioni dell’intensità della luce e dei colori / motivi delle pareti agli angoli dell’arena sono ridotte al minimo.
Diversi fattori dovrebbero essere considerati quando si ripete l’attività per aumentare la replicabilità tra le sessioni di codifica / test e ridurre al minimo l’influenza della ripetizione. In primo luogo, i contesti distinti (tanto quanto il numero di ripetizioni di sessioni di codifica / test) devono essere progettati per evitare l’accumulo di memoria spaziale che potrebbe essere causato dall’esecuzione delle sessioni ripetute utilizzando lo stesso contesto. Per raggiungere questo obiettivo, è stato utilizzato un apparecchio con pareti sostituibili di diversi colori e motivi (Figura 1B, C). Le pareti distinte e gli oggetti 3D (come giocattoli o piccoli oggetti di uso quotidiano di colori e forme distinte, vedi protocollo e Figura 1C)appesi alle pareti sono i segnali spaziali e i punti di riferimento che i ratti potenzialmente usano per imparare le posizioni degli oggetti in relazione ai loro contesti. Nel caso in cui un test non riesca a produrre la preferenza per l’oggetto spostato, è possibile prendere in considerazione la modifica di questi parametri del contesto (design della parete e segnali spaziali). In alternativa, un’arena di forma rettangolare o circolare può essere utilizzata per le attività di localizzazione degli oggetti invece di un’arena quadrata come in questo protocollo. Le arene circolari sono segnalate per eliminare le preferenze d’angolo22 che si osservano spesso nelle arene con angoli e, quindi, può essere utile quando si tratta di un ceppo di ratto o topo particolarmente ansioso. Mentre i requisiti per la creazione di quattro contesti distinti in questo protocollo funzionano in modo ottimale con una forma quadrangolare, un’arena circolare può anche essere resa funzionale dopo alcune regolazioni.
In secondo luogo, gli intervalli tra ogni sessione di codifica / test dovrebbero essere determinati in modo tale che i ratti mantengano lo stesso livello di interesse ogni volta, evitando al contempo il rischio di apprendimento cumulativo derivante da un denso programma di ripetizioni. Di solito, è sufficiente un intervallo di almeno il doppio della lunghezza del tempo di ritardo tra la codifica e le prove di prova, con intervalli più lunghi più favorevoli per più di due ripetizioni. Ciò significa che, mentre un intervallo minimo di 48 ore dopo un test di 24 ore è sufficiente per una o due ripetizioni, l’uso di un intervallo di 1 settimana è raccomandato per quattro ripetizioni. Come mostrano i risultati nella Figura 5 e il confronto con ANOVA, l’attività può essere ripetuta con successo quattro volte. Sulla base di questo, il protocollo stabilito può essere utilizzato per controbilanciare fino a quattro condizioni sperimentali. Il numero di gruppi sperimentali determina il numero di ripetizioni di sessioni di codifica/sperimentazione in contesti distinti. I risultati nella Figura 5 rappresentano un possibile modo di utilizzare il protocollo con due gruppi sperimentali. I gruppi sono stati controbilanciati in due sessioni e le stesse condizioni sono state ripetute in due sessioni aggiuntive (a scopo di convalida). La seconda serie di sessioni controbilanciate potrebbe anche essere utilizzata per controbilanciare nuove condizioni. Allo stesso modo, tre o quattro condizioni sperimentali possono essere confrontate utilizzando tre o quattro sessioni controbilanciate, rispettivamente.
In questi casi, i contesti dovrebbero essere progettati per adattarsi alle caratteristiche contrastanti descritte nel protocollo. È interessante notare che il design controbilanciato potrebbe non essere adatto per esperimenti in cui devono essere utilizzate ulteriori manipolazioni, come un intervento farmacologico che potrebbe lasciare un effetto o un danno di lunga durata. Per mantenere l’efficacia e la replicabilità dei test, l’esperimento dovrebbe essere progettato di conseguenza. I dati provenienti da test ripetuti possono essere presentati e analizzati in diversi modi, come dimostrato nella Figura 5. Per un’analisi iniziale, i gruppi sperimentali in ciascun contesto possono essere confrontati individualmente a livello di casualità utilizzando un t-testdi un campione per determinare qualsiasi preferenza significativa (Figura 5B,D). Questo può essere utile per ottenere una rapida comprensione dei dati, ma garantisce solo un confronto indiretto dei gruppi. Quindi, per confrontare due o più gruppi, i dati dovrebbero essere analizzati utilizzando rispettivamente t-test a due campioni (accoppiati o spaiati) o ANOVA. Questo può essere sotto forma di confronto tra soggetti dei gruppi all’interno di una singola sessione di codifica/ test(Figura 4A e Figura 5B,D)o confronto all’interno del soggetto dei gruppi da due (o più) contesti controbilanciati ( Figura5C,E). Quest’ultimo metodo è fortemente raccomandato, soprattutto quando si tratta di condizioni di memoria deboli, che, come spiegato in precedenza, si traduce in un’elevata varianza dovuta alla casualità nel comportamento.
La combinazione dei contesti controbilanciati porta a gruppi più grandi che sono necessari per visualizzare in modo affidabile il comportamento del gruppo con variazioni minime. Utilizzando un protocollo con ripetizioni in sessioni controbilanciate, ci si può aspettare una diminuzione del numero di ratti a circa un terzo del numero che sarebbe richiesto utilizzando un singolo test con la stessa potenza statistica. Di solito, le dimensioni del campione in un intervallo da 7 a 15 ratti (totale) per sessioni controbilanciate e in un intervallo da 20 a 50 ratti (da 10 a 25 per gruppo) per una singola sessione con una dimensione dell’effetto e una potenza entrambe superiori a 0,8 sono sufficienti. La diminuzione del numero di animali necessari e l’aumento delle informazioni che otteniamo da ciascun animale utilizzando questo protocollo affina lo studio e serve i principi 3R degli usi etici degli animali nella ricerca. È importante in questa fase tenere presente che il comportamento casuale del ratto, che non è accompagnato da una memoria forte, può comportare preferenze individuali forti sia al di sotto che al di sopra del caso, ma la media del gruppo dovrebbe produrre una preferenza non significativamente diversa dal caso. I dati individuali devono essere interpretati con attenzione. La distribuzione di singoli punti dati all’interno di un gruppo può anche essere informativa per interpretare i risultati. Come si vede nella Figura 4 e nella Figura 5, la distribuzione cambia a seconda della forza della memoria. Nel complesso, il protocollo qui presentato può essere seguito facilmente per implementare il compito di localizzazione dell’oggetto con ripetizioni per modellare la memoria spaziale a breve e / o lungo termine. Il protocollo di formazione semplice e flessibile e la possibilità di implementare ulteriori manipolazioni rendono questo compito una scelta popolare. Queste modifiche al protocollo consentono l’analisi di passaggi particolari come l’acquisizione della memoria, il consolidamento e il richiamo.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O’Hara e David Bett per commenti e suggerimenti approfonditi. Questo studio è stato sostenuto da Erasmus+ (a G.B. e L.N.); la Graduate School of Health, Università di Aarhus (a K.H.); Novo Nordisk Foundation Young Investigator Award 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) e PROMEMO – Center for Proteins in Memory, un centro di eccellenza finanziato dalla Danish National Research Foundation (DNRF133) (a T.T.).
Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |