Un projet de science citoyenne a été conçu pour recruter des résidents de San Diego afin de recueillir des échantillons environnementaux pour le SARS-CoV-2. Une plate-forme Web multilingue a été créée pour la soumission de données à l’aide d’une interface conviviale pour les appareils mobiles. Un système de gestion de l’information de laboratoire a facilité la collecte de milliers d’échantillons géographiquement diversifiés grâce au suivi des résultats en temps réel.
Pour contrôler la transmission communautaire du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) pendant la pandémie mondiale de 2020, la plupart des pays ont mis en œuvre des stratégies basées sur des tests humains directs, le couvre-visage et la désinfection des surfaces. En supposant que la principale voie de transmission comprend les aérosols et les gouttelettes respiratoires, les efforts pour détecter le SARS-CoV-2 chez les vecteurs ennemis se sont concentrés sur les endroits soupçonnés d’une prévalence élevée (p. ex. les services hospitaliers, les navires de croisière et les systèmes de transport en commun). Pour enquêter sur la présence du SARS-CoV-2 sur des surfaces de l’environnement urbain qui sont rarement nettoyées et rarement désinfectées, 350 citoyens ont été enrôlés du grand comté de San Diego. Au total, ces citoyens scientifiques ont recueilli 4 080 échantillons. Une plateforme en ligne a été mise au point pour surveiller la livraison et le ramassage des trousses d’échantillonnage, ainsi que pour recueillir des données d’échantillons. Les trousses d’échantillonnage ont été principalement construites à partir de fournitures disponibles dans les magasins stressés par la pandémie. Les échantillons ont été traités à l’aide de réactifs faciles d’accès malgré la pénurie récurrente d’approvisionnement. Les méthodes utilisées étaient très sensibles et résistantes aux inhibiteurs couramment présents dans les échantillons environnementaux. La conception expérimentale et les méthodes de traitement proposées ont réussi à mobiliser de nombreux citoyens scientifiques qui ont recueilli efficacement des échantillons dans diverses zones de surface. Le flux de travail et les méthodes décrits ici sont pertinents pour étudier l’environnement urbain à la recherche d’autres virus, qui sont préoccupants pour la santé publique et constituent une menace pour de futures pandémies.
On pense que le SARS-CoV-2 se transmet principalement par inhalation d’aérosols et de gouttelettes contaminés par contact direct avec des personnes infectées1,2,3,4. Cependant, au cours des phases initiales de la pandémie mondiale de COVID-19, les efforts visant à contrôler la transmission du SARS-CoV-2 se sont fortement concentrés sur la désinfection des surfaces, le lavage des mains et la désinfection. À la fin de 2020, les directives de transmission de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS)5 et des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis6 ont jugé que la transmission par voie aérienne présentait un danger, principalement lorsqu’elle était en contact étroit (<2 m) avec une personne infectée ou en présence d’interventions médicales génératrices d’aérosols. L’auto-inoculation après un contact avec des surfaces contaminées ou l’inhalation de vecteurs fomites aérosolisés n’a pas encore été exclue comme voie de transmission du SARS-CoV-2.
Des cas de COVID-19 ont été signalés où la transmission par voie aérienne semble peu probable7,8. Les virions du SARS-CoV-2 restent infectieux sur le cuivre jusqu’à 8 h, sur le carton et l’acier inoxydable jusqu’à 24 h, et sur le plastique jusqu’à 48 h9. Dans les cabines des navires de croisière, l’ARN du SARS-CoV-2 a été détecté 17 jours après le départ des passagers7. Des échantillons d’air et de surface provenant d’hôpitaux et de systèmes de transport en commun ont été testés positifs pour le SARS-CoV-2 et d’autres coronavirus8,10 , 11,12,13,14. Une étude réalisée sur l’emballage extérieur des bonbons d’Halloween manipulés par des patients COVID-19 asymptomatiques et modérés / légèrement symptomatiques a conclu que la combinaison du lavage des mains par le manipulateur et du lavage des bonbons avec du savon pour les mains réduisait l’ARN du SARS-CoV-2 à des niveaux inférieurs au seuil15.
Plusieurs méthodes de diagnostic du SARS-CoV-2 ont été publiées sur la base de la réaction en chaîne de la polymérase à transcription inverse en temps réel (RT-qPCR)16,17,de l’amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse (RT-LAMP)11,18,19,20,21et des technologies CRISPR-Cas18,19,22,23. La plupart nécessitent des kits d’extraction d’ARN qui sont souvent en pénurie pendant les périodes de demande mondiale importante, et très peu ont été utilisés pour le dépistage environnemental du virus24. Il a été démontré que la détection de l’ARN du SARS-CoV-2 à l’aide de RT-LAMP est concordante à plus de 83 % avec l’utilisation de RT-qPCR. En outre, RT-LAMP a entraîné une réduction de 25% des résultats non concluants par rapport à RT-qPCR15.
RT-LAMP est une technique simple qui utilise une transcriptase inverse pour synthétiser l’ADNc à partir d’un modèle d’ARN25,suivie d’une ADN polymérase avec une forte activité de déplacement de brin qui synthétise l’ADN à température constante (c’est-à-dire l’amplification isotherme)26. Une plus grande spécificité de la détection du génome viral est obtenue en utilisant quatre ou six amorces qui reconnaissent six ou huit régions de l’ADN cible. L’amplification est initiée à partir d’un apprêt interne et donne une structure d’ADN semi-double brin. Le brin avant est ensuite amplifié par un apprêt extérieur. Ces amplifications sont répétées pour les amorces inverses. Les amorces internes et externes à chaque extrémité ont un site auto-complémentaire inverse interne qui forme une boucle dans le produit d’amplification26,27. Dans le déplacement de brins isothermes, la synthèse asynchrone de l’ADN génère de grandes quantités de produit amplifié où la polymérisation continue amplifie le signal d’aussi peu que 10 copies par réaction11,20,28. Le mélange colorimétrique RT-LAMP est faiblement tamponné et utilise du rouge de phénol comme indicateur de pH. Comme la polymérase incorpore un nucléotide, elle libère un proton, et suffisamment de protons vont changer le pH de la solution ainsi que sa couleur du rose au jaune11,20,28,29.
RT-LAMP a été développé pour la détection des maladies transmises par les moustiques dans les établissements de santé périphériques qui ne disposent pas de laboratoires entièrement équipés25 et pour la détection rapide d’autres virus à ARN comme le virus de l’immunodéficience humaine30. Les populations les plus vulnérables en cas d’épidémie – selon la définition de l’OMS – manquent souvent de ressources économiques suffisantes et de l’équipement approprié pour effectuer la détection (Programme de santé publique mondiale des Nations Unies). Dans la pandémie actuelle de SARS-CoV-2, les fournitures telles que les écouvillons de qualité médicale et les réactifs pour les kits d’extraction d’ARN n’ont pas été en mesure de répondre à la demande mondiale, en particulier dans les pays non manufacturiers. Le protocole proposé utilisait une extraction d’ARN brut à base de thiocyanate de guanidinium (GITC), qui a effectivement préservé l’ARN d’une manière indépendante de la chaîne du froid et a réduit de manière significative la persistance des inhibiteurs de l’échantillon. De plus, le protocole d’extraction gitc-chloroforme est basé sur la séparation de l’ARN de l’ADN et des protéines suivie de la précipitation respective, permettant la récupération de la majeure partie du matériel génétique. Ces avantages l’emportent sur les dangers potentiels des citoyens scientifiques manipulant le produit chimique si des mesures sont prises pour les informer de manière appropriée des risques.
Le flux de travail proposé utilise des matériaux et des réactifs d’utilisation générale. Il nécessite un équipement disponible dans des laboratoires de base, souvent ruraux. Ces méthodes sont peu coûteuses, très résistantes aux inhibiteurs souvent trouvés dans les échantillons environnementaux ou les échantillons qui ne peuvent pas être traités avec des kits d’extraction, et éliminent le besoin d’un thermocycleur de haute précision. Cette étude présente un pipeline pour l’échantillonnage et la détection du SARS-CoV-2 à partir de réservoirs environnementaux sur des surfaces communément touchées et rarement désinfectées des ménages et de l’environnement urbain.
Engagement des citoyens scientifiques. Des citoyens scientifiques ont été recrutés pour écouvillonner les surfaces dans tout le comté de San Diego afin d’échantillonner et de détecter la présence du SARS-CoV-2 dans l’environnement urbain. La majorité des trousses d’échantillonnage livrées (70 %) ont été retournés au laboratoire, et de ce nombre, presque tous les échantillons étaient complets (91 %) (Figure 3A,B et Tableau 4). Les bénévoles pouvaient facilement demander la livraison ou le ramassage des trousses par l’entremise de la plateforme Web, et le logiciel de planification des itinéraires de livraison demandait aux citoyens scientifiques d’estimer les heures d’arrivée, deux facteurs probablement importants pour le succès observé. Le délai moyen entre la livraison de la trousse au citoyen scientifique et le moment où elle a été retournée au laboratoire était de 8 jours, avec une médiane de 3 jours et une fourchette de 1 à 64 jours (figure 3A et tableau 4). Des rappels plus fréquents aux bénévoles réduiraient probablement ce délai.
La plateforme de collecte de données a été utilisée avec succès par une grande majorité d’utilisateurs (73 %) (Tableau 4). Bien que les efforts des citoyens scientifiques n’aient pas été mesurés, des tests sur le terrain ont montré que la plate-forme de collecte de données réduisait considérablement les efforts et le temps nécessaires pour mener à bien le prélèvement d’échantillons. Ainsi, la réduction de la quantité de comptabilité a encouragé l’engagement des citoyens scientifiques. La plate-forme Web visait à surmonter les limitations démographiques en fournissant un service de traduction automatique neuronal multilingue et en fournissant des protocoles graphiques et audiovisuels en anglais et en espagnol. Cela n’a été que partiellement réussi, car moins d’échantillons ont été prélevés à la fois dans la baie Sud et dans le comté de North, où réside la majeure partie de la population hispanique / latino ducomté, soit 45personnes. Ces zones abritaient également 63% (1 700 cas pour 100 000) du nombre total de cas de COVID-19 dans le comté de San Diego avec la prévalence la plus élevée de la maladie46 et le taux d’hospitalisations (62%)47,48. Bien que la plupart des échantillons proviennent du comté de Central, un nombre représentatif a été recueilli dans les districts les plus touchés par la COVID-19 et seule une petite fraction des échantillons était positive, ce qui suggère que les réservoirs de surface du SARS-CoV-2 dans l’environnement urbain sont relativement rares.
Traitement des échantillons. Les écouvillons d’échantillonnage ont été mouillés avec des FDS, qui ont désactivé le virus en perturbant son enveloppe et stabilisé l’ARN nu en dépliant RNases32. Idéalement, pendant le prélèvement, le détergent dans l’écouvillon a nettoyé la surface échantillonnée. Les échantillons environnementaux contiennent souvent de très petites quantités d’ARN. Pour maximiser la récupération, l’isolement de l’ARN a été effectué à l’aide d’une méthode d’extraction brute, sans colonne, basée sur GITC. Gitc, un agent chaotrope fort, perturbe les liaisons hydrogène qui maintiennent le repliement des protéines (c.-à-d. effet hydrophobe). Cette action se traduit par l’inactivation des particules virales, et l’ARN reste stable en raison de l’inhibition des RNAses34,35,36. La solution GITC a maintenu la stabilité des échantillons d’ARN sans tenir strictement compte de la chaîne du froid, ce qui a permis aux citoyens de maintenir les échantillons à température ambiante si un congélateur pour les blocs réfrigérants fournis n’était pas disponible. Afin de réduire le danger potentiel que pose ce réactif en cas de contact direct avec la peau ou les muqueuses, les citoyens ont été sensibilisés à ces risques par l’inclusion d’une fiche signalétique fournie dans la trousse et un sceau d’avertissement a été placé dans la boîte contenant les tubes.
La méthode brute d’extraction de GITC-chloroforme a aidé la récupération des traces d’ARN des écouvillons, et comme le montre l’amplification des échantillons enrichis, les inhibiteurs ont rarement persisté dans les échantillons après extraction. Les échantillons, qui étaient négatifs pour le SARS-CoV-2 et ne présentaient aucune inhibition de RT-LAMP, représentaient de vrais négatifs ou avaient un nombre de copies inférieur à celui de la LD à une fréquence de 100 %. Inversement, la détection de l’ARN viral sur une surface n’implique pas directement un risque de transmission par contact, car l’infectiosité du virus à partir d’échantillons positifs doit être testée. Un dépistage rapide de l’environnement, qui n’est pas limité par la disponibilité de fournitures sophistiquées ou de personnel hautement qualifié, est essentiel pour évaluer si les surfaces constituent un réservoir viral et pour mieux orienter les efforts de prévention et de confinement.
RT-LAMP a été choisi pour être la meilleure méthode adaptée au pipeline de détection proposé. Il s’est avéré être une méthode rapide et peu coûteuse qui était fortement résistante à la plupart des inhibiteurs restants et aussi sensible et spécifique que d’autres méthodes RT-qPCR. En raison de leur utilisation en milieu clinique pendant la pandémie de SARS-CoV-2, la disponibilité des kits RT-qPCR a été affectée par la demande mondiale. De plus, les techniques rt-qPCR , même celles formulées pour résister aux inhibiteurs, étaient sensibles aux substances contenues dans les échantillons environnementaux recueillis par une cohorte pilote de citoyens scientifiques, même après l’utilisation d’autres stratégies communes pour réduire la concurrence des inhibiteurs pour la liaison enzymatique49. Ces résultats sont corroborés par une étude récente qui a comparé les deux méthodes pour détecter le SARS-CoV-2 sur des échantillons d’écouvillons de bonbons manipulés par des patients COVID-19 et a trouvé une concordance de résultats de plus de 83%, avec une inhibition inférieure de 25% dans les échantillons analysés par RT-LAMP15. En outre, l’extraction du brut GITC-chloroforme, couplée à RT-LAMP, a réduit le coût des réactifs et des fournitures de 42% par rapport à l’extraction du kit d’ARN et au RT-qPCR (Table des matériaux).
Cette méthode a permis d’analyser à haut débit des milliers d’échantillons d’écouvillonnage de surface. Jusqu’à 80 piscines, représentant 640 échantillons, ont été traitées en 2 jours, de l’extraction de l’ARN à la détection du SARS-CoV-2 par RT-LAMP. Le protocole proposé est semi-quantitative, limité à la détection de l’ARN viral, et n’indique pas la présence de particules virales infectieuses. Une analyse plus approfondie est nécessaire pour évaluer le risque de transmission du SARS-CoV-2 par les vecteurs ennemis infectés présents aux surfaces écouvillonnés.
Cette étude présente un protocole pour mettre en place rapidement une stratégie de test qui comprend un flux de travail efficace face à une urgence sanitaire avec une maladie transmissible. Le protocole d’échantillonnage proposé est simple et utilise des fournitures que l’on trouve couramment dans les ménages, et la méthode de détection virale est effectuée sur de l’équipement disponible dans des laboratoires de base tels qu’un bain d’eau au lieu d’un thermocycleur. Les coûts des réactifs RT-LAMP sont nettement inférieurs à ceux nécessaires pour le RT-qPCR et moins sensibles aux scénarios de demande mondiale élevée. Cette étude sert de cadre à l’évaluation des réservoirs viraux environnementaux lors de futures épidémies et pandémies mondiales.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les chercheurs du Viral Information Institute (VII), la Dre Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, le Dr Gregory Peters, le Dr Stuart A. Sandin et la Dre Jennifer Smith d’avoir pris le temps de prélever de nombreux échantillons. Nous remercions également le Dr Rob Knight, le Dr Jack Gilbert, le Dr Pedro Balda-Ferre et la Dre Sarah Allard du département de pédiatrie de l’École de médecine de l’Université de San Diego en Californie (UCSD) d’avoir facilité les contrôles positifs et les commentaires utiles. Nous remercions Stacey Carota (SDSU College of Sciences) et Gina Spidel (SDSU) pour leur soutien logistique et Juan Rodríguez pour l’art et la conception graphique du protocole d’échantillonnage. Nous remercions tous les participants pour leur engagement et leur dévouement à ce projet en ces temps très difficiles. Ce travail a été soutenu par un généreux don de la Dre Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) et de la subvention RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 de la National Science Foundation (numéro de bourse : 2030479).
SMP, LIMS, and community outreach: | |||
Authentication Application Programming Interface | Google Sign-In | ||
Commercial hosting platform | GoDaddy | ||
Data Charting Application Programming Interface | Google Charts | ||
Database software | MySQL | ||
Delivery route planning software | Circuit | Circuit for Teams | |
Free email service | Google Email | ||
Geospatial Application Programming Interface | Google Maps API | ||
Multilingual neural machine translation service | Google Translate | ||
Online form | Google Form | ||
Operating system | Linux | ||
Web and database development | Big Rose Web Design | ||
Web server software | Apache | ||
Sampling kit: | |||
Coolers | Coleman (Amazon) | B00363X3F2 | Cost (US$) per 100 rxns: 70 |
Gallon Ziploc bags | Solimo (Amazon) | B07BJ495GL | Cost (US$) per 100 rxns: 18 |
Glycerol (hand sanitizer) | FischerScientific | G33-4 | Cost (US$) per 100 rxns: 9 |
Ice packs | Ice-Brix (Amazon) | B075GLD3X1 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Isopropanol (hand sanitizer) | FischerScientific | AA36644K7 | Cost (US$) per 100 rxns: 43 |
KN95 masks | Echo-Sigma | Echo-Sigma | Cost (US$) per 100 rxns: 400 |
Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet | Office Depot | 348037 | Cost (US$) per 100 rxns: 36 |
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) | Anyumocz (Amazon) | B07T64FHXR | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes | Genesee Scientific | 22-281 | Cost (US$) per 100 rxns: 83 |
Sample ID solvent resistant labels | LABTAG | XST-10C1-1WH | Cost (US$) per 100 rxns: 68 |
Swiffer WetJet pads (swabs) | Swiffer (Amazon) | B001F0RBT2 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Toothpicks | Kitchen Essential (Amazon) | B00PBK4NG6 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution – GITC), not LS | Invitrogen | 15596018 | Cost (US$) per 100 rxns: 40 |
Tube boxes | Genesee Scientific | 21-119 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
Small Ziploc bags | Ziploc (Amazon) | B01LRKEI9K | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer | Zebra | GK420t | |
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160 | |||
Trizol RNA extraction: | |||
Ammonium Acetate RNase-free | Invitrogen | AM9070G | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
Chloroform | FisherScientific | C298-500 | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) | Invitrogen | AM9515 | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol | FisherScientific | BP2818500 | Cost (US$) per 100 rxns: 30 |
Molecular-grade Isopropanol | FisherScientific | BP2618500 | Cost (US$) per 100 rxns: 3 |
TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Multiplexed colorimetric RT-LAMP: | |||
Guanidine Hydrochloride | Alfa Aesar | AAJ6548522 | Cost (US$) per 100 rxns: 1 |
RT-LAMP E1-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
RT-LAMP N2-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG | NEB | M1800S | Cost (US$) per 100 rxns: 210 |
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler | Eppendorf | 950030010 | |
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470 | |||
Kit for RNA extraction: | |||
QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 61904 | Cost (US$) per 100 rxns: 570 |
RT-qPCR: | |||
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Applied Biosystems | 4444432 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes | IDT | 10006713 | Cost (US$) per 100 rxns: 20 |
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix | Quantabio | 95132-100 | |
QuantiNova Pathogen | Qiagen | 208652 | |
QuantiNova Probe | Qiagen | 208352 | |
UltraPlex 1-Step ToughMix | Quantabio | 95166-100 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855196 | |
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 | |||
RT-PCR: | |||
SuperScript IV One-Step RT-PCR | Invitrogen | 12594025 | |
Lab cleanup: | |||
DNAZap | Invitrogen | AM9890 | |
RNAZap | Invitrogen | AM9780 |