Neurodegenerative sygdomme er forbundet med dysregulerede mikrogliafunktioner. Denne artikel skitserer en in vitro assay af fagocytose af neuroblastom celler ved iPSC-makrofager. Kvantitative udlæsninger af mikroskopi er beskrevet for både live-celle time-lapse imaging og fast celle højindhold billeddannelse.
Microglia orkestrere neuroimmune reaktioner i flere neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom og Alzheimers sygdom. Microglia rydde op døde og døende neuroner gennem processen med efferocytose, en specialiseret form for fagocytose. Fagocytosefunktionen kan forstyrres af miljømæssige eller genetiske risikofaktorer, der påvirker mikroglia. Dette papir præsenterer en hurtig og enkel in vitro mikroskopi protokol til undersøgelse af mikroglial efferocytose i en induceret pluripotente stamcelle (iPSC) model af mikroglia, ved hjælp af en menneskelig neuroblastom celle linje (SH-SY5Y) mærket med en pH-følsomme farvestof til fagocytisk last. Proceduren resulterer i et højt udbytte af døde neuroblastomceller, som viser overfladefosfatylserin, anerkendt som et “spis-mig” signal af fagocytter. 96-brønd plade assay er velegnet til live-celle time-lapse imaging, eller pladen kan med succes fastsættes forud for yderligere behandling og kvantificeret ved højindhold mikroskopi. Mikroskopi med højt indhold med fast celle gør det muligt at skaleres analysen op til screening af små molekylehæmmere eller til vurdering af den fagocytiske funktion af genetiske variant iPSC-linjer. Mens denne analyse blev udviklet til at studere fagocytose af hele døde neuroblastomceller ved iPSC-makrofager, kan analysen let tilpasses til andre laster, der er relevante for neurodegenerative sygdomme, såsom synaptosomes og myelin og andre fagocytiske celletyper.
Microglia er hjernevæv-resident makrofager, og deres funktioner omfatter immunovervågning, koordinere inflammatoriske reaktioner på skade / infektion, synaptisk remodeling, og fagocytose af døde celler, myelin, protein aggregater, og patogener. Phagocytose er den proces, hvorved mikroglia genkender last med overfladereceptorer og reorganiserer deres cytoskeleton for at opsluge objektet til en fagocsome, som derefter smelter sammen med lysosomer til nedbrydning af lasten. Sunde mikroglia phagocytose apoptotiske hjerneceller til at fjerne dem, før de bliver nekrotiske1. Fagocytose af apoptotiske celler er også kendt som efferocytose, og kræver visning af en fosfattidylserin “eat-me” signal af den døende celle2. Talrige mikroglia receptorer direkte binde sig til fosfattidylserin, herunder TIM-4, BAI1, Stabilin-2, og TREM2. Mikrogliale TAM-receptorer (f.eks. MERTK) og integriner binder sig indirekte til fosfattidylserin ved hjælp af tilbehørsproteinerne GAS6 eller MFG-E8. Andre “eat-me”-signaler kan være nødvendige for anerkendelse af døende celler, disse omfatter ændringer i glykosylation eller ladning af overfladeproteiner; ekspression af intracellulære proteiner ICAM3, calreticulin, annexin-I ved celleoverfladen oxideret LDL; eller belægning af apoptotiske celler med mikroglia-produceret komplement C1q1,2.
Neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, frontotemporal demens, og amyotrofisk lateral sklerose har været forbundet med svækkelse af microglia funktion, herunder en ophobning af hjerneaffald produkter såsom døde celler, myelin fragmenter, og protein aggregater, og overdrevne inflammatoriske reaktioner på disse stimuli3. Fagocytose kan være nedsat i neurodegenerative sygdomme og bidrage til patologien på grund af en kombination af aldring, betændelse eller specifikke genetiske risikovarianter4,5. På den anden side er der også beviser fra dyremodeller af neurodegenerative sygdomme, at mikroglia uhensigtsmæssigt kan phagocytose levedygtige neuroner eller synapser6,7,8. Mekanismen vil sandsynligvis blive anstiftet af fosfattidylserin display af beskadigede neurites, som er direkte fornemmes af mikroglial fagocytose receptorer TREM2 eller GPR56, eller indirekte fornemmes ved opløselig supplement C1q belægning fosfatylserin-beriget membran, hvilket fører til CR3-medieret phagocytose9,10,11.
In vitro-analyser af fagocytosefunktion, f.eks. for at vurdere den fænotypiske virkning af en genetisk risikovariant i mikroglia, udføres ofte ved hjælp af ikke-fysiologiske laster som latexperler4. Fluorescerende mærkede bakterier og zymosaner anvendes også, som er fysiologiske, men ikke relevante for neurodegenerative sygdomme. Ikke-fysiologiske fagocytiske laster kan bruges til at opdage defekter i de grundlæggende maskineri af fagocytisk opslugning, men undlader at præcist model det første “anerkendelse” skridt i fagocytose af apoptotiske neuroner. Størrelsen, formen, stivheden og typen af last dikterer også de intracellulære signalveje, der aktiveres, hvilket fører til forskellige resultater af mikrogliaaktiveringstilstand. For eksempel er E.coli-bakterier små og stive, i modsætning til menneskelige celler, og lipopolysaccharider på deres overflade genkendes af Toll-lignende receptor 4 (TLR4), der aktiverer fagocytose og proinflammatoriske signalveje2,12.
I forbindelse med neurodegenerative sygdomsundersøgelser ville en mere relevant fagocytisk last have fosfatylserindisplay på pattedyrs plasmamembraner og ideelt set være menneskelige og neuronale for at inkludere signaler, som mikroglia sandsynligvis vil støde på. Til denne fagocytose protokol, den menneskelige neuroblastom celle linje SH-SY5Y blev valgt som en neuron model, der er let at kultur. Permanent overfladephosphatidylserin display blev kunstigt induceret af paraformaldehyd, som tidligere har vist sig at forårsage fosfattidylserin visning af blodplader13. For mikroglia celle model menneskelige iPSC-makrofager blev anvendt, som efterligner ontogeny og transcriptional profil af menneskelige mikroglia, og er fagocytisk kompetente14,15,16,17. iPSC-makrofager er ikke den mest autentiske mikroglia-model, der findes, f.eks. man kan dog erstatte det med en mere autentisk monokultur iPSC-model af mikroglia, hvis det ønskes, såsom Haenseler et al.15. Humane iPSC-modeller er at foretrække frem for primær gnavermikroglilia til undersøgelse af neurodegeneration på grund af bekymringer om den begrænsede overlapning af mikroglia-transskriptionsmoduler observeret hos human versus mus neurodegenerative sygdomsvæv18. De døde SH-SY5Ys er plettet med en syre-følsomme farvestof, fluorescer svagt ved neutral pH og stærkere inde i fagagolyomer af iPSC-makrofager efter fagocytose. Ved hjælp af et syrefølsomt farvestof forbedres nøjagtigheden af detektering af fagocytiske hændelser med alsidighed til forskellige udlæsninger af levende og faste makrofager19. Denne protokol skitserer både live-celle time-lapse imaging af fagocytose, og en fast højindhold imaging assay for phagocytose, med de samme celle forberedelse trin før udlæsning (Figur 1).
Figur 1: Skemat diagram over metodologi. Omrids af fagocytoseanalysen, hvor fremstilling af SH-SY5Ys og farvning af iPSC-makrofagerne udføres parallelt, og derefter ledes SH-SY5Y’erne på iPSC-makrofagerne. Enten udføres levende celletidsfordårlig billeddannelse med det samme, eller cellerne inkuberes ved 37 °C/5% CO2 i den krævede varighed og fastsættes, før der udføres mikroskopi med højt indhold. PFA: paraformaldehyd, HBM: phenol rød-fri HEPES-buffered medier, pHr: pH-følsomme rød fluorescerende farvestof STP Ester løsning, PRFMM: phenol rød-fri makrofag medier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Microglia har vigtige funktioner, der påvirker indledningen og progressionen af neurodegenerative sygdomme, herunder fagocytose af apoptotiske neuroner. Nedsat mikroglial phagocytose og uhensigtsmæssig fagocytose af synapser har begge været forbundet med neurodegenerative sygdomme, selv om de underliggende mekanismer og årsagssammenhæng ikke er velforstået4,23. Dette papir skitserer en fagocytose assay til måling af fagocytose af apoptotiske celler ved iPSC-makrofager, med enten en levende celle time-lapse imaging udlæsning eller fast celle højt indhold mikroskopi, eller en kombination af begge på en enkelt analyse. Denne alsidighed betyder, at analysen kan bruges til at studere individuelle fagocytiske begivenheder over tid i et par brønde eller bruges til højindhold screening med flere betingelser eller behandlinger. Da analysen med højt indhold er fastgjort på et enkelt tidspunkt, kan flere analyseplader fremstilles samtidigt. Den højindhold assay har potentiale nytte til karakterisering makrofager / mikroglia med sygdomsrelaterede genetiske varianter eller screening små molekyle hæmmere for ændringer i fagocytose. Analysen kan også let tilpasses til at studere fagocytose af andre mikroglia modeller, eller potentielt astrocytter. Den phagocytose assay kan potentielt multiplexed med levende celle imaging pletter, f.eks mitokondrier, calcium, eller ROS indikatorer, og post-fiksering immunofluorescent farvning for proteiner-of-interesse kan udføres. Sammenlignet med eksisterende fagocytose assays, der udnytter apoptotiske neuronale celler, de vigtigste fordele, at denne protokol giver er, at forberedelsen af den fagocytiske last er relativt enkel og hurtig, og resulterer i et ensartet produkt. Andre analyser fremkalder apoptose af neuroner eller SH-SY5Ys med S-nitroso-L-cystein i 2 h25, okadainsyre i 3 h22, staurosporin i 4-16 h26,27,28,29 eller UV-bestråling i 24 timer30, og kan resultere i celler på forskellige stadier af apoptose. Desuden er live-celle billeddannelse og højt indhold billeddannelse udlæsninger ikke tidligere blevet beskrevet, så vidt forfatterne er klar over. Den største begrænsning ved at bruge paraformaldehyd-fiksering til at forberede den fagocytiske last er, at den ikke fuldt ud generobrer apoptoseprocessen, da fiksering forhindrer cellerne i at opdeles i apoptotiske kroppe, som sandsynligvis vil blive phagocytosed hurtigere på grund af deres mindre størrelse. Det vides ikke, hvilken effekt fiksering har på udskillelsen af nukleotid “find mig” signaler (f.eks ATP, UDP) fra målcellen, der tiltrækker fagocytter. Svarende til apoptotiske celler, de faste SH-SY5Ys udviser nogle membran permeabilitet til propidium jod. Membran permeabilitet er forbundet med frigivelsen af “find mig” signaler; Dette er dog ikke blevet undersøgt i de faste SH-SY5Ys, og hvis nukleotid frigives for hurtigt, vil de blive vasket væk, før SH-SY5Ys føjes til iPSC-makrofagerne.
Det første kritiske skridt i protokollen er farvning af døde SH-SY5Ys med en STP ester af en pH-følsomme rød fluorescerende farvestof. Dette farvestof reagerer hurtigt og kovalent med frie primære aminer på overfladen af de døde SH-SY5Ys. Varigheden af farvning behøver ikke at blive optimeret; Der skal dog udvises forsigtighed med håndtering af farvestoffet, inden mærkningen mærkes. Mærkningsreaktionen må ikke udføres i buffere, der indeholder frie aminer. Desuden er der risiko for nedbør, hvis DMSO-bestanden fortyndes i kold vandig buffer eller ved høj endelig koncentration. Bundfald vises som tætte mørke objekter under mikroskopet. Derudover klæber den pH-følsomme farveopløsning til almindelige plastcentrifugrør og vaskes langsomt af; Derfor anbefales lavbindende rør til mærkningstrinnet. Brug af et pH-følsomt farvestof, i stedet for et permanent fluorescerende farvestof, hjælper med at identificere opslugte partikler versus partikler, der nabo til plasmamembranen. Da der er en vis fluorescens ved neutral pH, skal tætheden af fagocytisk last og iPSC-makrofager holdes lav nok til nøjagtig segmentering, selv om den er høj nok til, at mange fagocytiske hændelser fanges. Mikroskopi med højt indhold var i stand til præcist at identificere fagocytose med en medium massefylde af last i brønden (mere end 2 SH-SY5Ys pr. iPSC-makrofag). Omvendt, på grund af svagere følsomhed af mikroskopet i det dybe røde spektrum, segmentering af iPSC-makrofager i live-celle time-lapse billeddata var mindre sikker, og det var nødvendigt at bruge en meget lav tæthed af last til at reducere sandsynligheden for falske positiver (1 SH-SY5Y for hver to iPSC-makrofager). Validering af korrekt segmentering og lasttæthed bør udføres med sammenligninger mellem ubehandlede og cytochalasin D-behandlede brønde. I en veloptimeret analyse, cytochalasin D bør reducere det gennemsnitlige antal pletter per celle med 90% i forhold til ubehandlede prøver.
Et andet vigtigt trin i protokollen er iPSC-makrofag farvning, som gør det muligt for cellen at blive identificeret og segmenteret i billedanalyse, således at eventuelle eksterne SH-SY5Ys er udelukket fra optællingen. Det anbefalede farvestof er cellepermeant, konverteret til et uopløseligt fluorescerende produkt inden for cytoplasmaet, fixable og ikke-giftigt (se Materialetabel). Farvningstrinnet blev optimeret til brug af iPSC-makrofager med højindhold imaging fagocytose assay, og vi foreslår, at det skal optimeres igen, hvis andre celletyper anvendes. Varigheden af cellefarvning kan øges for at forbedre aflejringen af det uopløselige fluorescerende produkt i cellerne. Hvis farvekoncentrationen optimeres, skal det sikres, at man undgår toksiske niveauer af det organiske opløsningsmiddelkøretøj.
Den tredje afgørende faktor for analysens succes er dataanalysen. De leverede analyserørledninger er beregnet til at være vejledende snarere end præskriptive, da forskelle i farvningsintensitet eller cellemorfologi kan reducere effektiviteten af segmentering af rørledningerne som skrevet. Der vil derfor være behov for visse optimeringer med test af pipelinen på passende positive og negative kontroller, og de parametre, der skal optimeres, er angivet i protokolteksten. Negative kontroller bør omfatte en tilstand, hvor iPSC-makrofager forbehandles med en potent fagocytosehæmmer, såsom cytochalasin D før tilsætning af SH-SY5Ys. En anden mulig negativ kontrol er tilsætning af SH-SY5Ys til tidligere ubehandlede brønde af iPSC-makrofager i slutningen af analysen, 10 minutter før fiksering, som tillader en vis afregning af lasten, men er for kort til en betydelig mængde fagocytose at forekomme. En fagocytosehændelse defineres som et rødt fluorescerende objekt inden for grænserne af en iPSC-makrofag, defineret af softwarealgoritmen ved hjælp af den dybe røde fluorescenskanal. Hvis segmentering af cellerne er dårlig (Figur 2), kan mange ikke-fagocytosed SH-SY5Ys i umiddelbar nærhed af iPSC-makrofager fejlagtigt indgå i analysen, dvs falske positiver. Den vigtigste faktor for at opnå god segmentering er streng afgrænsning af iPSC-makrofagerne. Segmentering for begge analyser er automatiseret, så det er ikke muligt at opnå perfekt segmentering for hver celle; Et par parametre kan dog justeres for at gøre segmentering mere optimal ved hjælp af et par testbilleder som reference. Cytochalasin D-styringen er vigtig for vurderingen af optimal segmentering, fordi et stort antal fagocytiske hændelser, der opdages i denne tilstand, indikerer, at segmentering er suboptimal. Optimering af dataanalysepipelinen bør ideelt set gentages, indtil antallet af fagocytiske hændelser pr. celle er 80%-90% lavere i cytochalasin D-tilstanden versus ingen hæmmer.
De problemer med fagocytoseanalysen, der er mest tilbøjelige til at forekomme, er: (1) svag pH-følsom fluorescens i positive kontroller, (2) sparsom eller ujævn fordeling af makrofager i slutningen af analysen eller (3) et højt antal falske positiver i analysen fra ikke-phagocytosed SH-SY5Ys. Fejlfinding af svag pH-følsom fluorescens bør først kontrollere, at farvning af SH-SY5Ys resulterede i en celle pellet med en stærk magenta farve. Hvis farven er svag, skal du sikre dig, at der anvendes et friskfarvelager, sikre, at mærkningsbufferen er aminefri, tilføje en ekstra vask til SH-SY5Ys før farvning, kontrollere, om det korrekte antal SH-SY5Y’er blev farvet, sikre, at der ikke er nogen farvetryk, og optimere mærkningskoncentrationen af farvestoffet. Hvis SH-SY5Ys er stærkt farvede, kontrollere, om koncentrationen tilsat til assay plade er korrekt, og sikre, at iPSC-makrofager er sunde og ikke for gamle. Den anden type problem, ujævn makrofagfordeling, kan skyldes tab af celler under pipettering, og der bør tages skridt til at reducere de pipetteringskræfter, som cellerne oplever, så man undgår smalborespidser. Hvis problemet forbliver, reducere inkubationstiden for lastning af iPSC-makrofager med cellepermeant farvestof. Det tredje problem med hensyn til fejlagtig optagelse af ikke-fagocyste partikler i analysen viser, at der er behov for mere optimering af analysepipelinen. Fejlfinding bør først og fremmest fokusere på cellesegmentering, og om softwaren indeholder tilstødende objekter. Specifikke parametre, der kan justeres, foreslås i noterne under de relevante trin (trin 6.1.11-6.1.15 for analyse af tidsfald med levende celler og trin 6.2.4-6.2.8 til analysen af højt indhold). Hvis cellesegmenteringen ikke kan forbedres yderligere, har analysen af højt indhold et ekstra trin (trin 6.2.8), der udelukker forkert segmenterede iPSC-makrofager. Desuden kan modulet, der filtrerer accepterede pletter af pH-følsom fluorescens i iPSC-makrofager, optimeres, hvilket øger tærskelintensiteten af accepterede objekter, hvilket skulle bidrage til at udelukke ikke-fagocytosed SH-SY5Ys (trin 6.1.17 til live-celle time-lapse-analysen og trin 6.2.11 til analysen med højt indhold).
Vi udviklede to typer af mikroskopi udlæsning for fagocytose assay, at hver har fordele og begrænsninger. Live-celle time-lapse imaging har den fordel at give ekstra information om fagocytose kinetik og er mere bredt tilgængelige end højt indhold billeddannelse platforme. Den anbefalede open source-software er agnostiker til mikroskopkilden og kan bruges med ethvert fluorescerende mikroskop af god kvalitet med eller uden live-celletidsforgang. Den vigtigste begrænsning af live-celle billeddannelse er begrænset følsomhed og optik, hvilket gør det mere udfordrende at opdage og udføre god segmentering af iPSC-makrofager. Denne begrænsning kan afhjælpes enten ved at øge varigheden af iPSC-makrofagfarvning eller ved at skifte til et mere følsomt mikroskop, hvis det er tilgængeligt. Den højindhold imaging fagocytose assay er den anbefalede udlæsning, hvis et højt indhold billeddannelsessystem er tilgængelig. Højindhold billeddannelsessystemer muliggør højere gennemløb og mere pålidelige data, gør det muligt at bruge denne analyse til screening, hvor en robust Z ‘på ≥0,7 ville forventes for “antallet af pletter pr celle” output20. Sammenlignet med live-celle time-lapse metode, det høje indhold mikroskopi udlæsning har højere følsomhed, en højere grad af automatisering og hastighed, flere brønde og billedbehandling felter kan behandles, og høj opløsning confocal billeder er produceret. Cellesegmentering er mere effektiv med gode billeder, og segmentering er desuden hjulpet af højindhold billedanalyse software giver flere celle segmentering metoder egnet til stærkt uregelmæssigt formede celler. Den højindhold imaging analyse software også beregnet flere parametre for fagocytose, sammenlignet med open source-software, såsom procentdelen af fagocytiske celler. Den vigtigste begrænsning af højindhold fagocytose assay er en af omkostninger og tilgængelighed af billedbehandling system og analyse software.
Afslutningsvis er den kvantitative fagocytoseanalyse, der præsenteres i dette papir, et nyttigt værktøj til modellering af mikroglia-phagocytose af døde neuroner in vitro. Mikroglia er modelleret af iPSC-makrofager og de døde neuroner er modelleret af paraformaldehyd-faste SH-SY5Ys. Selvom det ikke er de mest autentiske mikroglia og døde / apoptotiske neuronmodeller offentliggjort, er disse nemme at forberede og skalerbare. Analysen selv er meget alsidig, med to typer af billedbehandling udlæsning detaljeret, og det har potentiale til at blive tilpasset til brug med forskellige microglia / makrofag monokultur modeller, eller en anden celletype til at fungere som fagocytisk last. Den højindhold imaging udlæsning er fordelagtigt for at opnå kvantitative data og kan skaleres op til assay små molekyle modulatorer af fagocytose, eller skærmen genetiske varianter i iPSC-makrofager. Men da højindhold billeddannelsessystemer er dyre og datatunge, er en alternativ billedbehandlingsudlæsning blevet inkluderet i protokollen ved hjælp af et live-celle time-lapse mikroskop, som kan erstatte ethvert konventionelt fluorescensmikroskop af god kvalitet, hvis det er nødvendigt.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Val Millar og Dr. Sohaib Nizami for deres hjælp med mikroskopi med højt indhold og Dr. Daniel Ebner for adgang til mikroskoper med højt indhold. Desuden forfatterne takke Dr. Emma Mead for assay udvikling rådgivning, og Fru Cathy Browne for iPSC støtte. Dette arbejde blev støttet af Alzheimers Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, tilskud reference ARUK-2020DDI-OX), med yderligere støtte til James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) fra Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award fra Parkinsons UK (J-1403); MRC Demens Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnerskab MR/N013255/1 og Momentum MC_PC_16034 Awards.
15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 352096 | For centrifugation of cells |
2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes | |||
2-mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | Component of Factory media |
4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | J61899 | For fixation of cells |
6-well plate, tissue culture treated | |||
AggreWell-800 24-well plate | STEMCELL Technologies | 34815 | Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies |
Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit | Abcam | ab14085 | Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide. |
Automated cell counter | |||
Benchtop centrifuge | |||
Benchtop microcentrifuge | |||
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay |
CellProfiler software | Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0. | ||
CellTracker Deep Red dye | Thermo Fisher | C34565 | Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. |
Class 2 laminar air flow safety cabinet | |||
CO2 gas bottle | Accessory for EVOS FL Auto | ||
CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2 | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis System | Perkin Elmer | Columbus | Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments. |
Cytochalasin D | Cayman | 11330 | Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM. |
DMEM/F12 | Gibco | 11320074 | Component of SH-SY5Y media |
DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for CellTracker and pHrodo dyes |
EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher | AMF4300 | Live-cell time-lapse imaging microscope |
EVOS Light Cube CY5 | Thermo Fisher | AMEP4656 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Light Cube DAPI | Thermo Fisher | AMEP4650 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Light Cube RFP | Thermo Fisher | AMEP4652 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Onstage Incubator | Thermo Fisher | AMC1000 | Accessory for EVOS FL Auto |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | Component of SH-SY5Y media |
Flow cytometer | |||
Flow cytometry analysis software | |||
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413302 | hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-038 | Component of both Factory and Macrophage media |
HBSS | Lonza | BE 10-547F | Hank’s balanced salt solution for washing steps |
Human recombinant BMP4 | Gibco | PHC9534 | Component of Embryoid Body media |
Human recombinant IL-3 | Gibco | PHC0033 | Component of both Factory and Macrophage media |
Human recombinant SCF | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Component of Embryoid Body media |
Human recombinant VEGF | Gibco | PHC9394 | Component of Embryoid Body media |
Live Cell Imaging Solution | Thermo Fisher | A14291DJ | Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys |
Low protein binding 2 mL tubes | Eppendorf | 30108.132 | For staining SH-SY5Ys |
M-CSF | Thermo Fisher | PHC9501 | Component of both Factory and Macrophage media |
mTeSR1 Medium | STEMCELL Technologies | 85850 | iPSC media |
Multichannel 20-200 uL pipette | For liquid handling of 96-well plate | ||
NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher | R37605 | Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media. |
Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | HH14000000 | High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9. |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media |
pHrodo iFL Red STP-Ester | Thermo Fisher | P36011 | pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. |
Serological pipette filler | |||
T175 flask, tissue culture treated | Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories" | ||
T75 flask | Vessel for SH-SY5Y culture | ||
Transparent plate sealers | Greiner Bio-One | 676001 | For assay plate storage and transportation |
TrypLE Express (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat. |
Water bath, set to 37°C | |||
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red | Lonza | BE04-418F | Component of Factory and Macrophage media |
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red | Lonza | 04-744Q | Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors |