iPSC-巨噬细胞死亡神经母细胞的体外定量成像检测
Summary
神经退行性疾病与受管制的微胶质功能障碍有关。本文概述了iPSC巨噬细胞对神经母细胞的体外测定。定量显微镜读数用于活细胞延时成像和固定细胞高含量成像。
Abstract
Microglia 在多种神经退行性疾病（包括帕金森病和阿尔茨海默病）中协调神经免疫反应。微胶质通过卵母细胞病（一种特殊形式的噬菌细胞病）清除死神经元和垂死神经元。影响微胶质的环境或遗传危险因素可能会破坏噬细胞功能。本文提出了一个快速而简单的体外显微镜方案，用于研究微胶质细胞细胞病在诱导多能干细胞（iPSC）模型的微胶质，使用人类神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）标记的pH敏感染料为噬菌体货物。该程序导致死亡神经母细胞的高产量，显示表面磷脂素，被噬细胞识别为”吃我”信号。96 井板测定适用于活细胞延时成像，或在进一步处理和高含量显微镜量化之前可以成功修复该板。固定细胞高含量显微镜使检测能够扩大规模，以筛选小分子抑制剂或评估基因变异iPSC线的噬菌体功能。虽然这种检测是为研究iPSC-巨噬细胞对整个死亡神经母细胞的噬菌体形成而开发的，但这种检测可以很容易地适应与神经退行性疾病相关的其他货物，如突触体和骨髓，以及其他噬菌细胞类型。
Introduction
微胶质是脑组织常驻大噬细胞，其功能包括免疫监测、协调对损伤/感染的炎症反应、突触重塑以及死细胞、骨髓、蛋白质聚集物和病原体的噬菌体。咽喉病是微胶质通过表面受体识别货物并重组其细胞骨架将物体吞没成咽喉体的过程，然后与溶酶体融合，使货物降解。健康的微胶质噬菌体凋细胞在它们成为坏死1之前将其去除。凋亡细胞的噬菌体病也被称为卵细胞细胞增多症，需要通过垂死的细胞2显示磷脂素”吃我”信号。许多微胶质受体直接与磷脂蛋白结合，包括 TIM-4、BAI1、斯大林-2 和 TREM2。微胶质TAM受体（例如，MERTK）和集成物分别使用附件蛋白GAS6或MFG-E8间接结合到磷脂蛋白。其他”吃我”信号可能是识别垂死细胞所必需的，这些信号包括糖化或表面蛋白质电荷的变化：细胞内蛋白质ICAM3、钙化物、附素-I在细胞表面的表达：氧化低密度脂蛋白;或通过微胶质生产的补充C1q1，2涂层凋细胞。
神经退行性疾病，包括帕金森病、阿尔茨海默氏症、前额痴呆症和肌萎缩性侧索硬化症，都与微胶质功能受损有关，包括脑废物（如死细胞、骨髓片段和蛋白质聚合物）的积累，以及对这些刺激的夸张炎症反应。由于年龄老化、炎症或特定遗传风险变异4、5的结合，噬细胞病可能在神经退行性疾病中受损，并有助于病理学。另一方面，从动物模型的神经退行性疾病也有证据表明，微胶质可能不适当地噬菌体活性神经元或突触6，7，8。该机制很可能是由受损的中性粒细胞的磷脂素显示引起的，这种神经素直接由微胶质噬菌体受体TREM2或GPR56感知，或通过可溶性补充C1q涂层的磷脂素富集膜间接感知，导致CR3介导噬细胞病9、10、11。
对噬细胞功能的体外测定，例如，评估微胶质中遗传风险变异的表型影响，经常使用乳胶珠4等非生理货物进行。还使用荧光标记的细菌和酶，它们是生理的，但与神经退行性疾病无关。非生理噬菌体货物可用于检测噬菌体吞没基本机制的缺陷，但未能准确建模凋亡神经元噬菌体形成的第一个”识别”步骤。货物的大小、形状、刚度和类型也决定了激活的细胞内信号通路，导致微胶质激活状态的不同结果。例如，大肠杆菌是小而僵硬的，不像人类细胞，其表面的脂质糖被像Toll一样的受体4（TLR4）识别，它激活了噬细胞增多症和亲炎症信号通路2，12。
在神经退行性疾病研究中，更相关的咽喉货物将在哺乳动物血浆膜上显示磷酸酯，理想情况下是人和神经元，以包括微胶质可能遇到的信号。对于这种噬菌细胞病协议，人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y被选为易于培养的神经元模型。永久表面磷酸酯显示是由副甲醛人为诱导的，此前已证明会导致血小板13的磷酸酯素显示。对于微胶质细胞模型人类iPSC巨噬细胞的使用，模仿人类微胶质的上基因和转录轮廓，是噬菌体能力14，15，16，17。iPSC-巨噬细胞不是最真实的微胶质模型，例如，它们不模仿微胶质形态：然而，如果需要的话，我们可以用它来代替更真实的单一栽培iPSC模型的微胶质，如海塞尔等人。人类iPSC模型比原发性啮齿动物微胶质更适合研究神经退化，因为担心在人类与小鼠神经退行性疾病组织18中观察到的微胶质转录模块的重叠有限。死亡的SH-SY5Ys被一种酸敏染料所染色，这种染料在中性pH值下微弱地荧光，在噬菌细胞增多后，在iPSC-巨噬细胞的噬菌体内更强烈地荧光。使用酸敏染料可提高检测噬菌体事件的准确性，对于活体和固定巨噬细胞的不同读数具有多功能性。本协议概述了噬细胞病的活细胞延时成像和噬菌细胞增多的固定高含量成像测定，在读出前具有相同的细胞准备步骤（图1）。
图1：方法图。咽喉病检测大纲，其中同步进行SH-SY5Ys的制备和iPSC巨噬细胞的染色，然后将SH-SY5Ys管道输送到iPSC-巨噬细胞上。要么立即进行活细胞延时成像，要么在规定时间内以 37 °C/5% CO2孵育细胞，并在执行高含量显微镜之前进行修复。PFA： 副甲醛， HBM： 苯酚无 HEPES 缓冲介质， pHr： pH 敏感红色荧光染料 STP 酯溶液， PRFMM： 苯酚无红大噬体介质。请单击此处查看此图的较大版本。
Protocol
该协议遵循牛津大学牛津帕金森病中心（伦理委员会：国家卫生服务、卫生研究局、英国伯克希尔州中南部的NRES委员会（REC 10/H0505/71）中得出的人类iPS细胞系的使用指南。人类 iPSC 将在 II 类安全柜内处理，以保护工人免受可能的冒险代理人的感染。必须遵守地方、国家和欧盟的健康和安全法规。细胞培养介质成分详见 表1，所有材料均列在 补充材料表中。 1. 实验前的细胞培养 iPSC 介质中的培养 iPSC （表 1） 在 6 井板中预先涂上 hESC 合格的地下室膜基质、子汇合和低通道编号。 将人类iPSC与iPSC-巨噬细胞前体区分开来：将400万支iPSC种子放入微井低粘性24井板中，用2ML的胚胎体介质（表1）来鼓励胚胎体的形成，并在5-6天内每天进行75%的介质变化。将胚胎体转移到T175瓶中，每个烧瓶中约有150个胚胎体，含有20兆L的工厂介质（表1）。每周添加 10-20 mL 的工厂介质。注：iPSC-巨噬菌体在大约2-3周后进入超高位，并连续生产几个月。对于此实验，最好在分化工厂建立后大约 6 周内使用细胞。早期收获的iPSC巨噬细胞可以保留一些增殖能力，并且不具有较少的粘附性，甚至防止在低细胞密度下播种。尚未确定噬菌体功能的年龄上限。 区分 iPSC-巨噬细胞前体到 iPSC-巨噬细胞：通过去除所需的超高纳特体量来收获前体：通过40μm细胞过滤器去除团块;离心机在400×g为5分钟颗粒细胞和悬浮在宏噬体介质（表1）。在 96 井组织培养 （TC） 处理的微板中，以每口井 20，000-30，000 个细胞的种子 iPSC-巨噬细胞，带黑井壁和光学清晰底部，每口井 100 微升的巨噬细胞介质。避开边缘油井，用PBS填充这些：这对于减少蒸发对检测的影响非常重要。通过在37°C/5%CO2的孵化中分化6-10天。注：对于此检测，使用了 iPSC 线路 BIONI010-C（ECACC ID：66540023）;但是，可以替换另一条 iPSC 线路。 将SH-SY5Ys与20mL的SH-SY5Y介质（表1）保持T75烧瓶的亚汇合，每3-4天通过一次。 名字 基础媒体 添加剂，最终浓度 iPSC 媒体 mTeSR1 – 胚胎体介质 mTeSR1 BMP4， 50 ng/mL VEGF， 50 ng/mL SCF， 20 ng/mL 工厂媒体 XVIVO15 格鲁塔马克斯， 2 mm 青霉素， 100 单位/mL 链霉素，100微克/mL 2-默卡普托乙醇，50μM IL-3， 25 ng/mL M-CSF， 100 ng/mL 宏法媒体 XVIVO15 格鲁塔马克斯， 2 mm 青霉素， 100 单位/mL 链霉素，100微克/mL M-CSF， 100 ng/mL SH-SY5Y 媒体 德梅姆/F12 胎儿牛血清， 10% 青霉素， 100 单位/mL 链霉素，100微克/mL 表1：媒体食谱。 协议中使用的细胞培养介质的构成。媒体组件的更多详细信息可在 材料表中找到。 2. 准备死亡的 Sh – sy5ys 在 II 类生物安全柜中，通过添加含有重组试丁酶的细胞分离缓冲器 4 mL 和 1.1 m EDTA（参见 材料表），分离 SH-SY5Ys，这些缓冲器应立即去除，以便小于 1 mL 的细胞保持为薄膜涂层。在 37 °C / 5% CO 2 下孵育2-3分钟。 在 T75 烧瓶中加入 10 mL 的 HBSS 以冲洗，并将 SH-SY5Ys 移液器放入 15 mL 圆锥形离心机管中。离心机在 400 x g 5 分钟。吸气超高分子，并重新悬浮在2mL的酚无 HEPES 缓冲介质的细胞（见 材料表）。确保小心地重新使用颗粒，用 100-1，000 μL 移液器管道在固定前分解碎块。 通过在管中加入 2 mL 的 4% 副甲醛（最终浓度 2%）来修复细胞。在室温下孵育10分钟，偶尔轻轻搅拌管子。 在管子中加入 10 mL 的 HBSS。离心机在 1，200 x g 7 分钟，并重新悬挂在 2 mL 的酚 无 HEPES 缓冲介质中。注：第 2.4 步后，固定 SH-SY5Y 制剂可以通过用附件 V-FITC 进行染色来实现质量控制，以显示可访问的磷酸酯和碘化丙胺，以流式细胞学读数测量细胞渗透性。比较从第 2.2 步获得的固定准备到活 SH-SY5Ys。请参阅第 7 节和 补充图 S1。不建议在步骤 2.4 之后存储固定 SH-SY5Y，因为尚未对此进行评估。 3. 用pH敏感红色荧光染料标记死SH-SY5Y 步骤 2.4 后，计算细胞，并将所需的细胞总数移入 2 mL 低蛋白结合管中。每 100 万 SH-SY5Ys，用苯酚无红 HEPES 缓冲介质将 2 mL 管的总体积增加到 300-500 μL。在 37 °C 的水浴中短暂加热管子。 重组pH敏感红色荧光染料STP酯（见 材料表），并在温暖的2mL细胞管中加入每百万SH-SY5Y12.5微克的染料。通过管道轻轻混合。在室温下孵育管子30分钟，不受光线照射。注：PH敏感染料的STP酯类与原发性胺发生反应，因此标签缓冲器不得含有免费胺。由于在水中缓冲器中溶解性可能有限，仅将 DMSO 溶解染料添加到温暖的水中缓冲器中，立即混合，并检查沉淀迹象（光显微镜下的暗颗粒）。 在 4 °C 下以 1200 x g 的速度加入 1 mL 的 HBSS 和离心机，7 分钟。 丢弃超高分子，用2 mL HBSS清洗。重复离心。 丢弃超高分子，并重新悬浮在苯酚无红大噬体介质中的细胞（见 材料表），浓度为20万-120万细胞/mL，使50微升为10，000-60，000个细胞（即 0.5x- 3 倍以上的 SH – Sy5ys 比 ipsc 巨噬细胞） 。注：介质中的酚红色会增加背景荧光，因此，如果要进行活细胞成像，应使用无酚红介质。不建议将染色 SH-SY5Y 存储超过几个小时，因为尚未对此进行评估。将染色的 SH-SY5Ys 放在冰上，防止光线照射。 4. 染色 iPSC 巨噬细胞 在生物安全柜中，准备深红荧光、细胞渗透、精密酯反应染料（见 材料表）的宏噬菌体介质解决方案。添加霍奇斯特33342（见 材料表）。在水浴中将工作溶液加热至 37 °C。 通过用多通道移液器将细胞超分子移入无菌储液池，轻轻吸气 iPSC-巨噬细胞介质。使用多通道移液器，将第 4.1 步准备的染料溶液的 70 μL/井添加到 iPSC 巨噬细胞中。在 37 °C/5% CO 2 下孵育1小时。 准备在苯酚无红大噬体介质中的实验性治疗。包括 10 μM 细胞查拉辛 D 作为负控制治疗。孵化后，用多通道移液器轻轻吸气 iPSC-宏法介质，并加入 100 μL/井汉克缓冲盐水溶液 （HBSS） 来清洗。立即通过轻柔的管道去除 HBSS，然后添加 100 μL 的介质±化合物。在 37 °C / 5% CO2下孵育 10 分钟 1 小时。注：细胞查拉辛D是一种有效的作用素抑制剂，可以阻断噬细胞增多症。对于任何需要更长潜伏时间的实验性治疗，例如 24-72 小时，请在步骤 4.1 之前使用全大噬体介质中的 100 μL/井进行实验性治疗。按照协议遵循步骤 4.1-4.3，以便进行细胞染色，然后在噬菌体抗血石分析的其余部分在无酚红色宏噬体介质中重新应用治疗。 5. 成像噬菌体 以下是两种不同的噬菌体读数方法，选择子节 5.1 或 5.2。 实时细胞延时成像 在噬菌细胞增多之前，打开活细胞延时成像显微镜（见 材料表）、计算机、环境室和 CO2 气体。打开图像捕获软件。检查 DAPI、RFP 和 CY5 光立方体是否安装在显微镜中。点击 时间延迟|孵化|启用环境室 ，选择加热到 37 °C 的 CO2 气体，也确保湿度被除选。让显微镜加热到 37 °C 时允许 30 分钟。 在步骤 4.3 的复合孵化过程中，将 iPSC-巨噬体板加载到显微镜中。 单击 “图片|捕获|船舶专家。选择 井板 ，并选择96井板类型。 在 “图像 “选项卡中，打开相位通道，使用垂直滑块调整粗糙和精细的对焦，使细胞处于对焦状态。用水平滑块调整照明水平。单击 DAPI、RFP 和 CY5 通道，调整每个通道的照明水平。 在 系统 选项卡中，单击 校准容器对齐 并按照屏幕说明操作。 点击 时间延迟|例行公事|创建新的常规。在 时间延迟向导的第一屏幕上，说出例程。点击 下一页。在第二个屏幕上，选择 20 倍目标，选择 单色 捕获，并选择 DAPI、RFP、CY5 和相声通道。不要选择以下选项：自动查找示例、自动精细对焦、Z 堆栈、自动照明。点击 下一页。 在下一个屏幕上，每个井的中心设置一个信标，这将使显微镜返回到相同的坐标与相同的照明设置，每个时间点。每个信标的对焦和照明设置是独立的。要设置信标：将蓝色圆圈拖动到板图上的位置，使用粗糙而精细的对焦垂直滑块，当满意时，单击 “添加信标”。以后可以使用” 更新选定 “按钮更新信标设置。 当准备开始咽细胞病检测时，取出检测板并将其放入生物安全柜中。使用多通道移液器每口井添加 50 μL SH-SY5Y，在液体边缘的每口井的侧面添加。 将板加载到显微镜中，等待约 30 分钟，热移位平衡。注：在显微镜中的前 30 分钟，检测板温度的变化将导致焦点转移。如果不允许板平衡，捕获的图像将在延时期间失去焦点。 单击每个信标并更新对焦设置。点击 下一页。在 时间延迟向导的下一个屏幕上，选择文件格式 TIFF，启用选项以 保存各个频道，并启用选项 为每个信标创建视频，并允许下面的选项 包括以下信息作为水印。点击 下一页。 将 场景数 设置为 1。点击 下一页。设置延时持续时间和间隔，例如，3 小时，每 5 分钟成像一次。不要只选择 捕获一帧。点击 下一页。 启用温度为 37 °C 和 CO2 的环境室（湿度可进行短期实验）。点击 下一个 两次。选择保存数据的路径。点击 下一页。单击 “开始” 开始延时。 固定细胞高内容成像 使用多通道移液器每口井添加 50 μL 标记的 SH-SY5Y，并添加到液体边缘的每口井的一侧。在 37 °C/ 5% CO2 下孵育 3-5 小时。 咽喉培养后，用多通道移液器轻轻吸气细胞超分子，并丢弃。用 100 μL PBS 洗一次。 通过添加 100 μL 的 2% 副甲醛来修复板材，在室温下孵育 15 分钟。 吸气井，并添加 100 μL 的 PBS。盖上板封口和铝箔;在 4 °C 下存储，直到需要为止。注：检测板可以这样存储至少一个星期，而不会显著信号降解：较长的存储时间尚未测试。 打开高含量成像显微镜（参见 材料表），打开图像捕获软件。通过单击屏幕顶部的 负载 图标将检测板加载到显微镜中。 选择 设置 选项卡。在左上框的下拉菜单中：选择合适的板型，选择自动对焦选项 双峰（默认），选择目标 40倍水，NA1.1，选择 Confocal 模式，并选择 1的装箱。 使用前通过 设置 菜单冲洗 40 倍的水目标。 在 通道选择 框中，使用 + 图标添加通道 DAPI、Alexa 647 和 Alexa 568。将这些设置为 1 μm 的单平面测量。优化 时间 和 功率 设置，提高检测板的染色效率。注：作为指导，将 DAPI 设置为 200 ms 曝光和 100% 功率，Alexa 647 设置为 1500 ms 曝光和 100% 功率，Alexa 568 设置为 100 ms 曝光和 40% 功率。 通过单击 通道序列 以分离通道，确保通道不会同时测量。 在 导航|下定义布局，选择测量井，每口井选择9-12个油田。 在设置过程中，单击板图上的代表性字段，然后依次检查每个测量通道，通过调整通道偏移确保污渍存在且图像集中。 要将数据上传到服务器进行远程分析，请单击 在线作业 框和相关屏幕名称：这将使数据在成像后能够自动上传到服务器。 单击”保存”按钮可 保存 检测协议。 单击顶部的 运行实验 选项卡并命名实验板，然后单击 “开始”。 6. 数据分析 以下是两种不同的数据分析方法，如果遵循子节 5.1，请选择子节 6.1，如果遵循子节 5.2，则选择子节 6.2。 活细胞延时显微镜获得的噬细胞变图像分析 下载并安装推荐的开源软件（参见 材料表）。打开软件。 在输入模块框中，选择 “图像”。 从 Windows 资源管理器中，打开数据文件夹，其中包含名为信标-1、信标-2 等子文件夹。选择并将所有信标文件夹拖入 文件列表 框。 在 输入模块框中 ，选择 元数据。对于 提取元数据？，选择 “是”。在 元数据提取方法旁边的下拉菜单中，选择 文件/文件夹名称中的提取物。对于 元数据源，请选择 文件夹名称。单击常规表达右侧的放大镜，然后键入”[\]**？P*）*”进入 Regex 文本框（不包括报价标记）。单击 “提交”。有关 摘录元数据，请选择 所有图像。单击屏幕底部的 更新 。图像现在将由信标分组。 在 输入模块框中 ，选择 名称和类型。以下过程将允许将每个时间点的图像分配到正确的荧光通道。将名称分配给 图像匹配规则 （向下向下的菜单）。选择规则标准与以下规则 的所有 （下拉菜单）相匹配。 文件 （向下菜单）、 是否 （向下菜单）、 包含 （向下菜单 ）、DAPI（ 文本框）。分配给这些图像的名称 DAPI（ 文本框）。选择图像类型 灰度图像e（向下菜单）。设置强度范围从 图像元数据 （向下菜单）。 在屏幕底部，单击”添加另一个图像”，并重复步骤 6.1.5。用RFP替换DAPI，以便将 RFP 图像分组。 CY5 通道图像重复步骤 6.1.6。 单击屏幕底部的 更新 ，图像文件现在将列在标有 DAPI、RFP 和 CY5 的三列中。 在输入模块框中，选择组。对于要对图像进行分组吗？ 在元数据类别的下拉菜单中，选择信标。 在 分析模块 框中，右键单击空白处以调用所有模块的列表。 单击 “添加|图像处理|增强或抑制功能。从第一个下拉框中选择 DAPI 作为输入图像。将输出图像命名为”DAP 花招”。选择操作类型 增强 和功能类型 Speckles，功能大小为 20 像素。选择速度和精度选项 快速/六角形。 创建新模块。 添加|对象处理|识别主要对象。从第一个下拉框中选择 DAP 花招 作为输入图像。命名主要对象”核”。将物体的典型直径输入 为 10 到 35 像素单位：此参数可以优化。选择阈值策略 Global，阈值法 RidlerCalvard，平滑方法 自动，并给出阈值校正因子为 12 与上下界 0-1。更改方法以将团块对象区分为 “形状”， 但在默认设置中保留其他参数。注：iPSC-巨噬细胞核在6.1.12步中大致被分割，遵循图像处理步骤，可减少直径并增加核对比度。重要的是，只有最亮的核选择，因为SH-SY5Ys将显示为较微弱的核，否则被误认为是iPSC-巨噬细胞。要调整所选核的比例，增加或减少阈值修正因子。在测试阶段，将生成的核选择与信标的相位图像进行比较，使用细胞形态可以轻松区分 iPSC-宏法奇和 SH-SY5Y。 创建新模块。 添加|图像处理|正确计算。从第一个下拉框中选择 CY5 作为输入图像。命名输出图像”IllumCY5″。有关 “如何照明”，请从下拉菜单中选择 “背景 “。将其他参数保留在其默认设置中。 创建新模块。单击 “添加|图像处理|更正发光应用。从第一个下拉框中选择 CY5 作为输入图像。命名输出图像”CorrCY5″。要 选择照明，请从下拉菜单中选择 IllumCY5。 有关 “如何照明”，请选择从下拉菜单 中分离 。注：步骤 6.1.13-6.1.14 的目的是校正 CY5 图像背景照明的变化，否则会干扰正确的细胞分割。 创建新模块。单击 “添加|对象处理|识别第二个对象。从第一个下拉框中选择 CorrCY5 作为输入图像。选择 核 作为输入对象。将次要对象命名为”Mac”。选择识别方法作为距离 -B。选择阈值策略 Global，阈值方法 里德勒卡尔瓦尔德， 平滑方法 没有平滑， 并给出阈值校正因子为 1 与上下界 0-1。将其他参数保留在其默认设置中。注：此单元格分割步骤可能需要优化，通过调整阈值校正因子来生长或缩小细胞边界。通过增加 iPSC-巨噬体染色强度或在成像过程中对 CY5 光立方体的照明，还可以提高分割效率。 创建新模块。单击 “添加|图像处理|增强或抑制功能。从第一个下拉框中选择 RFP 作为输入图像。将输出图像命名为”过滤的RFP”。选择操作类型 增强 和功能类型 Speckles，功能大小为 15 像素。可以优化功能大小。选择速度和精度选项 快速/六角形。 创建新模块。单击 “添加|对象处理|识别主要对象。从第一个下拉框中选择 过滤的RFP 作为输入图像。命名主要对象”pHr”。将物体的典型直径输入为 5-20 像素单位。选择阈值策略 手册，并手动键入阈值，例如 0.005。将方法更改为将团块对象区分为 “形状”， 但将其他参数保留在其默认设置中。注：SH-SY5Ys 已在步骤 6.1.17 中进行细分，遵循图像处理步骤，该步骤可减少直径并增加穿刺的对比度。执行手动阈值至关重要，因为 pH 敏感染料的强度会随着时间推移而增加，因此其他阈值策略会在早期点人为地膨胀 pH 感应染料穿刺的数量。使用测试模式，必须针对随后的每次实验重复调整手动阈值。 创建新模块。单击 “添加|对象处理|相关对象。从下拉菜单中选择输入儿童对象 pHr。 从下拉菜单中选择输入父对象 Mac。 要 计算所有儿童测量的每个父母的手段？，选择 “是”。不要计算孩子-父母的距离（无）。注：第 6.1.18 步将 pH 感应染料信号与 iPSC 巨噬细胞相关，从而能够测量每个 iPSC-巨噬细胞物体的平均数量。 创建新模块。单击 “添加|文件处理|出口到传播表。选择列划界器作为 Tab， 并添加文件名称的前缀以指示信标编号。选择具体的出口计量，如下所示（步骤 6.1.19.1 – 6.1.19.4）：将其他参数保留在其默认设置中。 图像|计数 |选择 pHr 和 Mac 图像|文件名 图像|群 麦克|儿童|phr 在 输出 框中，单击 “查看输出设置”。为此实验在桌面上创建一个新的文件夹，并将此设置为默认输出文件夹。 保存管道文件|保存项目作为… 通过单击左下角的 “开始测试模式”， 在具有代表性的图像上测试和优化管道。程序自动选择第一个图像进行测试，管道的每一步都可以通过单击眼睛符号来查看，使输出可见，然后单击 “运行”。要更改用于测试的信标，请在顶部菜单栏单击 测试|选择图像组。要更改信标中的图像（时间点），请单击顶部菜单栏，单击 测试|选择图像集。应优化的参数在以前的步骤中说明。 当对管道满意时，单击 退出测试模式 并单击睁开眼睛的符号以关闭它们。保存管道。单击 “分析图像 “以开始完整的图像分析。 生成的文本文件可以作为电子表格打开，并使用适当的电子表格软件，标有”图像”的文件将包含每个图像时间点的行，列表示参数。注 ：Count_Mac 和 Count_pHr 表示图像中 iPSC 巨噬细胞的数量和识别的 pH 敏感对象的数量。不要使用Count_pHr数据，因为计数包括未受噬的低光SH-SY5Y。该列 Mean_Mac_Children_pHr_Count 为单个图像（即信标的单个时间点）拍摄每个 Mac 的平均 phagocytosed pHr 对象数（步骤 6.1.18 关联目标）。 排列数据，使每个信标是电子表格上的单独列，图像按时间顺序排列，不同的参数占据电子表格工作簿的不同表。 将测量Mean_Mac_Children_pHr_Count乘以Count_Mac，生成每个图像的点参数数。计算每个信标的平均Count_Mac。将每个图像的点数除以该信标的平均Count_Mac，生成每个单元格的点数参数。注：第 6.1.26 步通过将数据正常化为信标所有时间点的平均 iPSC-巨噬量计数，纠正了 iPSC-巨噬计数 （Count_Mac） 中可能发生的任何错误波动。 将自噬细胞病开始的时间（最小）分配给每个图像行。 生成复制井/信标的手段和标准偏差。将每个细胞（y轴）的点数与时间（x轴）对比，以可视化噬细胞病率。 图2：高含量噬菌细胞分析中的细胞分割。 插图，以显示良好的和差的分割iPSC-巨噬细胞靠近非噬菌体SH-SY5Y，与第二个SH-SY5Y完全噬菌体。由于这两种细胞类型都显示为灰色，计算机分析所描绘的 iPSC-巨噬细胞边框被勾勒出来（蓝色）。如果排除在分析中，则算作噬菌细胞增多事件的 SH-SY5Ys 被勾勒为绿色或红色轮廓。中间的图像显示分割不良：iPSC-巨噬细胞具有亚最佳描述，包括细胞边界内的非噬菌体 SH-SY5Y，这将被算作噬菌细胞病事件。右侧的图像显示良好的分割，由于定义 iPSC-巨噬细胞边框的更严格的参数，导致非噬菌体 SH-SY5Y 被正确排除在分析之外。 请单击此处查看此图的较大版本。 用高含量显微镜获得的噬菌体病图像分析 登录到推荐的图像处理软件（参见 材料表）。 选择屏幕名称文件夹，成像从左侧菜单运行子文件夹。单击 图像分析 图标（带放大镜的屏幕）。在板布局上选择具有代表性的井，以设置分析管道。 第一个分析构建块是输入图像。将默认设置留作堆栈处理（单平面）和平场校正（无）。单击块右上角的 +标志，添加下一个构建基块，然后选择 “查找核”。 在 查找核中，将通道设置为 DAPI，将投资回报率人口设置为 无，将细分方法设置为 C。方法框包含一个下拉菜单，允许优化参数，并设置通用阈值（即 0.40）和区域（即 >30 μm2）。将输出人口命名为”核”。点击 +符号并选择 查找细胞质，添加下一个构建块。 在 查找细胞质，设置通道为 亚历克萨647 和方法为 B。方法框包含一个下拉菜单，允许优化参数，并设置通用阈值（即 0.45）和个人阈值（即 0.20）。点击 +符号并选择 “选择人口”，添加下一个构建块。注：正确优化细胞质分割至关重要，以便排除任何未被噬菌体但不排除噬菌体货物的相邻SH-SY5Y（见图2）。 在 “选择组”中，保留默认设置，即”人口 核”、” 方法常见过滤器”、” 删除边界对象”的刻度以及名为”核选择”的输出组。点击 +符号并选择 计算形态属性，添加下一个构建块。 在 计算形态属性时，将人口设置为 核选择，区域到 细胞，方法到 标准。在下拉菜单中，确保选择区域和圆度（μm2）。将输出人口命名为”形态细胞”。点击 +符号并选择 “选择人口”，添加下一个构建块。 在选择人口 （2） 中，选择所选的人口核，以及按属性筛选的方法。在过滤器 F1下的下拉箱中，选择形态细胞区 [μm2]。选择从下拉框到右侧的>，并在该框右侧的框中键入160。 将输出人口命名为”核选定 2″。点击 +符号并选择”查找点”，添加下一个构建块。注：此步骤将任何不适当的分割细胞和任何死细胞排除在进一步分析之外。可能需要通过增加或减少截止规模来优化。 在 查找点中，选择通道 Alexa 568，投资回报率人口 核选择 2，投资回报率区域 单元格，方法 B，并命名输出人口”点”。如有必要，可以使用下拉菜单优化该方法，并设置检测灵敏度（即 0.20）和拆分灵敏度（即 0.400）。点击 +符号并选择 计算形态属性，添加下一个构建块。 在 计算形态属性 （2） 时，选择人口 点、区域 点和方法 标准。在下拉菜单中，确保选择区域和圆度（μm2）。命名输出属性”形态点”。点击 +符号并选择 “选择人口”，添加下一个构建块。 在选择人口 （3） 中，选择人口斑点和方法按属性过滤。在过滤器F1下的下拉箱中，选择现货区[px 2]，>，20。在过滤器F2下的下拉箱中，选择现货区[px 2]，<，2500。在过滤器F3下的下拉箱中，选择形态学点圆度，>，0.6。在过滤器 F4下的下拉箱中，选择点到区域强度、>、2.5。将输出人口命名为”选定点”。点击 +符号并选择”选择人口”，添加下一个构建块。注：自动点选择将分割出许多微小的荧光斑点，这些斑点来自 iPSC-巨噬细胞内的自荧光体。此步骤旨在通过对斑点的面积、圆度和强度实施严格的截止，过滤掉自荧光体，可能需要一些优化。 在 选择人口 （4） 中，选择人口 核选择 2 和 方法过滤属性。在 过滤器F1下的下拉箱中，选择 点数，>，0.5。将输出群命名为”点正细胞”。单击 +符号并选择 “定义结果”，添加下一个构建块。 在 定义结果时，选择第一种方法作为 输出列表。默认设置是计算每个人口的对象数。单击 “人口：核选择 2” 的下拉菜单，确保 对象数 被勾选，并在 “适用于所有 下拉”菜单中选择 “所有”对于人口 点正细胞，确保 对象数 被勾选。对于其他人群，无需报告任何参数。选择第二种方法作为 公式输出，并键入公式 （a/b）*100。选择可变A 点正细胞-对象数，并作为可变B选择 核选择2-对象数。将输出命名为”点正细胞（%）”。 保存管道：单击图标 “保存分析”到磁盘 （带有向下箭头的软盘）。 单击图标 批次分析 （屏幕顶部的漏斗和齿轮符号）。从左边的实验文件夹中，选择原始数据文件，该文件应将选定的测量数更新为 1。在 分析选项 区域中，单击 方法的下拉菜单，并选择 现有分析。点击…脚本文件旁边的符号，并浏览保存的分析文件（后缀。aas）。然后，单击”开始分析”旁边的绿色箭头。可以通过单击 “工作状态 “（在屏幕的右上角）来监控分析进度。 分析完成后，单击选项卡 导出，选择实验文件夹，并选择目的地文件夹。离开默认设置（其中输出数据但不导出 TIFF 图像）并开始导出。 在适当的电子表格软件中将下载的文件作为电子表格打开。井被排列成行和列中的参数。选择标记为斑点正细胞 （%）的列中的数据，核选择 2 – 点数 – 每井平均数，以及核选定 2 – 总点面积 – 每井平均值，并将这些数据复制到每个参数的新鲜电子表格中。计算每个条件复制井的参数值，并酌情绘制图表。 7. 固定 SH-SY5Ys 同质性的质量控制检测 从第 2.2 步收集活 SH-SY5Y 的引线，并从附件素 V-FITC 染色套件（参见 材料表）中重新使用附件绑定缓冲器，浓度约为每 mL 200，000 个细胞。 从第 2.4 步收集固定 SH-SY5Y 的引线，并以每 mL 约 200，000 个细胞的浓度在附件结合缓冲中重新使用。 准备两个试管与5微升附件V-FITC和5微升碘化物（见 材料表）。将 500 μL 的实时 SH-SY5Ys 添加到一根管子中，将 500 μL 的固定 SH-SY5Y 添加到另一根管子中。 准备三个控制管：一个带有 5 μL 附件素 V-FITC，一个带有 5 μL 碘化物，一个管子是空的。将 1：1 的实时和固定 SH-SY5Ys 比率混合在一起，并将其中 500 μL 添加到每个控制管中。 通过管道轻轻混合管子。在室温下孵育10分钟，不受光线照射。 立即测量流量细胞计（Ex = 488 nm;Em = 530 nm） 使用 FITC 信号探测器 （通常为 FL1） 用于附件 V-FITC，以及用于碘化物的植物红素发射信号探测器 （通常为 FL2）。 使用任何流细胞学分析软件显示FITC与PI信号的点图，并使用矩形门面工具选择双负数。在双负数内，显示 FSC vs SSC，并使用多边形门禁工具在 FSC 和 SSC 非常低的人口周围创建一个排除门，该门被归类为碎片，因此被排除在进一步分析之外。将剩余事件显示为 FITC v PI 信号，并使用单色和未染色控件设置 FITC/PI、FITC®/PI、FITC -/PI® 和 FITC+/PI® 事件的象限门。注意：避免粗糙处理，漩涡，或长期孵化与活SH-SY5Ys，这可能人为诱导磷酸酯显示。立即开始流动细胞学。一个理想的结果是，FITC/PI-事件的比例在固定的SH-SY5Ys中<5%。代表结果见补充图S1。
Representative Results
使用先前概述的协议进行活细胞延时成像，野生型 iPSC 巨噬细胞每口井播种 20，000 个细胞。应用了不同数量的SH-SY5Y（每口10，000-30，000，以及从第3.1步的细胞计数估计），并且噬菌体抑制剂细胞查拉辛D与一些井预孵育（1h），作为控制抑制噬菌体的每个量SH-SY5Ys。在添加 SH-SY5Ys 后 40 分钟开始成像，并在接下来的 3 小时中以 5 分钟间隔捕获图像（数据包括最初的 40 分钟延迟）。 补充数据中包括一个具有代表性的延时视频，并分析了 图3中显示的定量数据。每口井的咽喉颗粒（点）数量为10，000 SH-SY5Y，随着时间的流变，每个细胞的噬菌体颗粒（点）数量呈线性增加，并且被细胞查拉辛D抑制了约50%。细胞查拉辛D的抑制力弱于预期，很可能是由技术或生物复制不足引起的，因为每个情况只有一口井被映射到三个图像字段。由于每口油井的SH-SY5Y（20，000和30，000）数量较高，噬菌体表现出较差的线性，可能是由于iPSC-巨噬细胞和SH-SY5Y在更拥挤的视野中分割不良。 固定细胞高含量成像使用先前概述的协议进行，野生型 iPSC 巨噬细胞为每口井 20，000 个细胞，几种不同数量的 SH-SY5Ys（每口井 10，000-80，000），检测板在 5 小时后修复并成像。图4A中显示了噬菌体病的代表性图像，图4B17中显示了分析的数据。增加SH-SY5Ys的数量导致每个细胞的噬菌体颗粒（点）数量增加;然而，SH-SY5Y 数量翻倍只会导致每个细胞的斑点数量增加 1.5 倍。这表明测试的量不是对噬菌体病的速率限制。随后，使用几种抑制剂（图4C）17验证了高含量成像噬菌体检测。在噬菌细胞增多前1小时预孵育时，该作用素聚合抑制剂细胞查拉辛D和贾斯普拉基诺利德分别显著抑制了91%和90%的噬细胞增多症。当细胞查拉辛D或黄斑蛋白用作负控时，检测的强力Z’分别计算为0.7和0.8。溶酶体酸化抑制剂巴霉素A1在咽细胞增多前1小时孵育时，将咽细胞增多31%。溶酶体酸化抑制剂与行为素抑制剂的较弱作用表明，检测内化货物可能不需要对咽喉进行完全酸化。重组附件五被用作控制，以专门阻止暴露在SH-SY5Ys表面的磷酸酯，防止咽喉受体访问配体，这是一个重要的”吃我”信号。在SH-SY5Y加入之前，在油井中加入重组附件V可显著减少30%的噬菌体病变。固定SH-SY5Y被证实使用荧光附件V探头暴露磷酸酯，而活SH-SY5Ys对附件V染色呈阴性（图4D）。 微胶质噬菌细胞受体TREM2此前已被证明对凋亡神经元21的噬菌体非常重要。TREM2的R47H突变是阿尔茨海默氏症晚发的风险基因，假定可以减少TREM223的配体结合。为了评估R47H TREM2和TREM2 KO的咽喉功能，使用WT/R47H/KO TREM217的同源iPSC-巨噬细胞线进行了定细胞高含量噬细胞检测。使用交错添加的咽喉货物（40，000 SH-SY5Ys）对几长度的噬菌体持续时间进行了测试，从1小时到5小时不等。由此产生的信号线性增加到4小时，在5小时（图5）17时稍微调平。与 WT 相比，TREM2 KO 中噬细胞率和容量（%点阳性细胞）明显降低，而 R47H TREM2 突变体未显示噬细胞变异。TREM2 KO细胞中的噬菌体缺陷不是由R47H TREM2突变表观的，似乎是因为TREM2功能足以支持正常的噬菌细胞增多。 图3： 活细胞延时噬细胞病测定示例数据。 采用野生型 iPSC 巨噬细胞 BIONI010-C （ECACC ID： 66540023） 以 5 分钟间隔 3 小时拍摄的死 SH-SY5Ys。图表上显示的时间来自噬菌细胞增多的启动，包括前 40 分钟没有测量。绘制了三口复制井中每个细胞的平均点数。10，000 SH-SY5Ys 的噬菌体通过 1h 预处理抑制 10 μM 细胞查拉辛 D，而较高量的 SH-SY5Y（20，000 和 30，000）具有噬细胞增多的次优量化。平均±标准偏差 （SD），N = 1 实验。 请单击此处查看此图的较大版本。 图4：对固定细胞高含量噬菌体检测的优化和验证。（A ） 由野生型iPSC-巨噬细胞BIONI010-C（ECACC ID：66540023）所测定SH-SY5Ys噬菌体的代表性高含量显微镜图像。显示 3 小时时间点，带 40，000 SH-SY5Y。荧光通道合并，iPSC-巨噬细胞污渍显示为红色，核显示为蓝色，SH-SY5Ys 显示为黄色。插入面板是图像放大3倍（B）的一部分，每细胞的斑点数，噬细胞死亡的SH-SY5Ys在5小时后，使用不同数量的货物添加野生类型的iPSC巨噬细胞。平均±平均值 （SEM） 的标准误差，用于 N = 3 收获。（C） 噬菌体病 （3h） 抑制与 10 μM 细胞查拉辛 D （Cyt）， 1 μM 巴菲洛霉素 A1 （巴夫）， 1 μM 贾斯普拉基诺利德 （与 1h 预处理;Jas）， 和 13 μg / ml 重组附件 V （同时添加到死亡的 Sh – sy5ys;安）。没有添加 SH-SY5Ys 的 iPSC-巨噬细胞被用作负控制 （-ve），正 （+ve） 控制未经处理 iPSC-巨噬细胞，添加 SH-SY5Ys。数据已正常化为重复实验的均值。意味着± SEM，用于 N = 3-6 收获和两个野生类型细胞线 （SFC840-03-03， 此行的描述描述在 （费尔南德斯等人21和 BIONi010-C）. 1 向 ANOVA 与邓内特的后临时测试， 与未经治疗的细胞的比较。 * p < 0.05， ***p < 0.001.（D） 新鲜固定的SH-SY5Ys污渍均匀用于磷酸酯素显示（附素V-FITC），且细胞渗透性有限（碘化物）。活的SH-SY5Ys不会为附件V-FITC或碘化物染色，除了培养中为数不多的死细胞上存在焦点污渍。数字在阿尔茨海默氏症研究与治疗17的许可下复制。请单击此处查看此图的较大版本。 图5： 在TREM2 KO中，噬菌体减少，但在R47H TREM2 iPSC巨噬细胞中减少。高含量的噬菌细胞病检测每口井执行 40，000 SH-SY5Y，并交错添加。参数的含量是量化的：每个细胞的斑点数、每个细胞的斑点面积之和（μm2）以及每个场含有噬菌体颗粒的细胞的百分比。数据被规范化为每个实验的基因型。平均± Sem， N = 3 收获。重复测量双向 ANOVA，Dunnett 的事后测试，每次与 WT 进行配对比较：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。数字在阿尔茨海默氏症研究与治疗17的许可下复制。 请单击此处查看此图的较大版本。 补充图 S1：SH-SY5Ys 制备的示例 QC。 分离的SH-SY5Ys被固定10分钟，然后用0%（活细胞）、1%和2%的副甲醛（PFA）清洗。细胞被附件素V-FITC和碘化物（PI）所染色，并立即通过流细胞学测量。在流细胞学分析软件中创建了颜色密度点图，使用单色和未染色控件放置象限门。象限以象限内事件的百分比为注释。活细胞主要在第四季度，固定细胞主要在第二季度。第 1 季度 = 附件 V-/PI-，第 2 季度 = 附件（V+/PI®），第 3 季度 = 附件（V+/PI），第 4 季度 = 附件（V-/PI-）（活细胞）。 请点击这里下载此文件。 补充视频：活细胞延时噬细胞病。 代表延时视频的SH-SY5Ys噬菌体由野生类型的iPSC巨噬细胞BIONI010-C（ECACC ID：66540023）。图像每 5 分钟拍摄 3 小时。视频被裁剪并以每秒 3 帧的速度运行，显示检测的最后 1.5 小时。酸敏染料染色SH-SY5Ys以红色显示，信号强度随着邻苯二甲酸化而增加。沾有霍奇斯特 33342 的细胞核以蓝色显示。 请点击这里下载此视频。
Discussion
微胶质具有影响神经退行性疾病的启动和进展的重要功能，包括凋亡神经元的噬菌体。虽然对4、23的基本机制和因果关系尚不清楚，但突触的微胶质噬菌体衰老和不适当的噬菌体病都与神经退行性疾病有关。本文概述了通过 iPSC-巨噬细胞测量凋亡细胞的噬菌细胞的噬菌体测定，包括活细胞延时成像读数或固定细胞高含量显微镜，或在单个检测中两者的组合。这种多功能性意味着检测可用于研究几个井中随着时间的推移的个别噬菌体事件，或用于多种条件或治疗的高含量筛查。由于高内容的检测固定在一个时间点，因此可以同时准备多个检测板。高含量的检测具有潜在的效用，用于用与疾病相关的基因变异来描述巨噬细胞/微胶质，或筛选小分子抑制剂以改变噬菌体。检测也很容易适应研究其他微胶质模型的噬菌体，或潜在的星形细胞。噬细胞病检测可能与活细胞成像污渍（如线粒体、钙或 ROS 指标）进行复用，并且可以执行感兴趣的蛋白质的固定后免疫荧光染色。与利用凋亡神经元细胞的现有噬菌细胞分析相比，本协议赋予的主要优势是，噬菌体货物的制备相对简单和快速，并产生统一的产品。其他检测诱导神经元凋亡或SH-SY5Ys与S-硝基-L-西斯坦为2h25，冈田酸为3h22，葡萄球菌 4-16h 26，27，28，29或紫外线照射为24h30，并可能导致细胞在不同阶段的凋亡。此外，就作者所知，活细胞成像和高内容成像读数以前没有描述过。使用半形态醛固定来准备噬菌体货物的主要局限性是，它不能完全回顾凋亡的过程，因为固定会阻止细胞分裂成凋亡体，由于体积较小，这些细胞很可能更快地被吞噬。目前还不清楚固定对核苷酸”找到我”信号（例如ATP，UDP）从吸引噬菌细胞的目标细胞分泌有什么影响。与凋细胞类似，固定的SH-SY5Ys表现出一些膜渗透性，以丙化碘化物。膜渗透性与”找到我”信号的释放有关：然而，这还没有在固定的SH-SY5Ys中研究过，如果核苷酸释放得太快，它们就会在SH-SY5Y被添加到iPSC-巨噬细胞之前被冲走。
协议中的第一个关键步骤是用pH敏感红色荧光染料的STP酯染色死SH-SY5Ys。这种染料与死亡的SH-SY5Ys表面的免费原胺快速、共价地反应。染色持续时间不需要优化;但是，在标记之前，必须小心处理染料。标签反应不得在含有免费胺的缓冲器中执行。此外，如果 DMSO 库存在冷水缓冲区稀释或最终浓度较高，则存在降水风险。沉淀物将作为密集的黑暗物体出现在显微镜下。此外，pH 感应染料溶液粘在普通塑料离心机管上，并缓慢洗掉：因此，建议在标签步骤中使用低绑定管。使用pH敏感染料，而不是永久荧光染料，有助于识别被吞没的颗粒，而不是相邻等离子膜的颗粒。由于中性 pH 值存在一些荧光，因此需要保持足够低的咽喉货物和 iPSC 巨噬细胞的密度，以便进行精确的分割，尽管其高度足以捕获许多噬菌体事件。高含量显微镜能够准确识别井中货物密度中等的噬菌体病（每口iPSC-巨噬细胞超过2SH-SY5Y）。相反，由于深红色光谱中显微镜的灵敏度较低，活细胞延时成像数据中 iPSC-巨噬细胞的分割不太自信，因此有必要使用非常低的货物密度来降低误报的可能性（每两个 iPSC 巨噬细胞 1 SH-SY5Y）。应通过比较未经处理的油井和细胞查拉辛 D 处理井来验证适当的分割和货物密度。在优化后的检测中，细胞查拉辛 D 应比未经处理的样本将每个细胞的平均斑点数减少 90%。
协议中的另一个关键步骤是 iPSC-巨噬细胞染色，它允许在图像分析中识别和分割该单元，以便将任何外部 SH-SY5Y 排除在计数之外。推荐的染料是细胞渗透剂，转化为细胞质内的不溶性荧光产品，可固定和无毒（见 材料表）。染色步骤进行了优化，以便使用高含量成像噬菌体检测的 iPSC 巨噬细胞，我们建议，如果使用其他细胞类型，应重新优化该步骤。可以增加细胞染色时间，以改善细胞内不溶性荧光产物的沉积。如果优化了染料浓度，应小心避免有机溶剂车辆的毒性水平。
检测成功的第三个关键因素是数据分析。提供的分析管道旨在提供指导，而不是规定性，因为染色强度或细胞形态的差异会降低书面管道分割的有效性。因此，需要进行一些优化，对管道进行适当的正负控制测试，并且应优化的参数在协议文本中注明。负控制应包括 iPSC 巨噬细胞在添加 SH-SY5Ys 之前使用强效噬菌体抑制剂（如细胞查拉辛 D）进行预处理的情况。另一种可能的负控制是，在检测结束时（固定前 10 分钟）将 SH-SY5Ys 添加到以前未经处理的 iPSC 巨噬细胞井中，这允许货物进行一些结算，但时间太短，无法发生明显数量的噬菌细胞增多。噬菌细胞增多事件被定义为 iPSC-巨噬细胞边界内的红荧光物体，由使用深红色荧光通道的软件算法定义。如果细胞的分割很差（图2），许多靠近iPSC-巨噬细胞的非噬菌体SH-SY5Y可能会错误地包含在分析中，即误报。实现良好细分的最重要因素是严格划定 iPSC 巨噬细胞。两种分析的分割都是自动化的，因此不可能为每个单元格获得完美的细分：但是，可以调整一些参数，使细分更加最佳，使用一些测试图像作为参考。细胞查拉辛 D 控制对于评估最佳分割非常重要，因为在此条件下检测到的大量噬菌细胞事件表明分割是次优的。数据分析管道的优化最好重复，直到每个细胞的噬菌体事件数比无抑制剂低 80%-90%。
最有可能发生的噬菌细胞病检测问题有：（1） 阳性对照组中对 pH 敏感荧光的弱，（2） 检测结束时巨噬细胞分布稀疏或不均匀：（3） 非噬菌体 SH-SY5Ys 分析中的大量误报。弱pH敏感荧光的故障排除应首先检查SH-SY5Ys的染色是否导致细胞颗粒具有强烈的品红色。如果颜色较弱，请确保使用新鲜染料库存，确保标签缓冲器无胺，在染色前向 SH-SY5Ys 添加额外的洗涤，检查 SH-SY5Y 的正确编号是否被染色，确保没有染料沉淀物的证据，并优化染料的标签浓度。如果 SH-SY5Ys 有很强的染色，请检查添加到检测板上的浓度是否正确，并确保 iPSC 巨噬细胞健康且不会太老。第二类问题，大噬体分布不均匀，可导致细胞在管道过程中丢失，应采取措施减少细胞经历的管道力，避免窄孔尖端。如果问题仍然存在，请缩短用细胞渗透染料加载 iPSC 巨噬细胞的孵化时间。第三个问题，关于在分析中错误地包括非噬菌体粒子的问题，表明需要对分析管道进行更多的优化。故障排除应首先侧重于单元格分割以及软件是否包括相邻对象。可调整的具体参数建议在相关步骤下方的说明中（活细胞延时分析步骤 6.1.11-6.1.15 步，高内容分析步骤 6.2.4-6.2.8）。如果不能进一步改进细胞分割，高内容分析有一个额外的步骤（第 6.2.8 步），排除了不适当的分割 iPSC 巨噬细胞。此外，可以优化过滤 iPSC 巨噬细胞中接受的 pH 感应荧光点的模块，提高接受对象的阈值强度，这应有助于排除非噬菌体 SH-SY5Ys（活细胞延时分析的第 6.1.17 步，高内容分析的步骤 6.2.11）。
我们开发了两种类型的显微镜读数，用于噬菌体检测，每个都具有优点和局限性。活细胞延时成像具有提供有关噬菌体活性学的额外信息的优点，并且比高内容成像平台更广泛。推荐的开源软件对显微镜源不可知，可用于任何优质荧光显微镜，无论有没有活细胞延时能力。活细胞成像的主要局限性是灵敏度和光学性能有限，这使得检测和执行良好的iPSC巨噬细胞分割更具挑战性。这种限制可以通过增加 iPSC-巨噬菌体染色持续时间或在可用时切换到更敏感的显微镜来缓解。如果有高内容成像系统，则高含量成像噬菌体检测是推荐的读出。高含量成像系统能够实现更高的吞吐量和更可靠的数据，使这种检测可用于筛选，其中，”每个细胞的点数”输出20的强健Z”预期为≥0.7″。与活细胞延时法相比，高含量显微镜读出具有较高的灵敏度、较高的自动化程度和速度，可处理更多的井和成像场，并产生高分辨率共聚焦图像。细胞分割对于良好的图像更有效，而细分还得益于高含量成像分析软件，该软件提供了更多适合高不规则形状细胞的细胞分割方法。与开源软件（如噬菌细胞的百分比）相比，高含量成像分析软件还计算了更多的噬菌体病参数。高含量噬菌体检测的主要局限性是成像系统和分析软件的成本和可访问性。
总之，本文提出的定量噬菌体测定是建模体外死亡神经元微胶质噬菌体的有用工具。微胶质由iPSC巨噬细胞建模，死神经元由副甲醛固定SH-SY5Ys建模。虽然不是最真实的微胶质和死/凋亡神经元模型发布，这些很容易准备和可扩展。检测本身是高度多才多艺的，有两种类型的成像读数详细，它有潜力适应使用不同的微胶质/巨噬细胞单一栽培模型，或不同的细胞类型，以充当噬菌体货物。高含量成像读数有利于获取定量数据，可放大以检测噬菌体的小分子调制剂，或在 iPSC-巨噬细胞中筛选基因变异。但是，由于高内容成像系统成本高且数据量大，因此使用活细胞延时显微镜已包含替代成像读数，如果需要，该显微镜可以替代任何高质量的传统荧光显微镜。
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢瓦尔·米勒博士和索哈伊布·尼扎米博士在高含量显微镜方面给予的帮助，以及丹尼尔·埃布纳博士获得高含量显微镜的机会。此外，作者感谢艾玛米德博士的检测发展建议，和凯茜布朗夫人的iPSC支持。这项工作得到了英国牛津药物发现研究所（ARUK ODDI，授予参考ARUK-2020DDI-OX）的阿尔茨海默氏症研究的支持，并得到了牛津马丁学校LC0910-004的詹姆斯·马丁干细胞设施牛津（S.A.C.）的额外支持;帕金森英国纪念碑信托发现奖（J-1403）;MRC痴呆症平台英国干细胞网络资本设备MC_EX_MR/N50192X/1、合伙M/N013255/1和动量MC_PC_16034奖。
Materials
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 352096 | For centrifugation of cells |
| 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes | |||
| 2-mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | Component of Factory media |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | J61899 | For fixation of cells |
| 6-well plate, tissue culture treated | |||
| AggreWell-800 24-well plate | STEMCELL Technologies | 34815 | Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies |
| Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit | Abcam | ab14085 | Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide. |
| Automated cell counter | |||
| Benchtop centrifuge | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay |
| CellProfiler software | Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0. | ||
| CellTracker Deep Red dye | Thermo Fisher | C34565 | Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. |
| Class 2 laminar air flow safety cabinet | |||
| CO2 gas bottle | Accessory for EVOS FL Auto | ||
| CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2 | |||
| Columbus Image Data Storage and Analysis System | Perkin Elmer | Columbus | Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments. |
| Cytochalasin D | Cayman | 11330 | Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM. |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320074 | Component of SH-SY5Y media |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for CellTracker and pHrodo dyes |
| EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher | AMF4300 | Live-cell time-lapse imaging microscope |
| EVOS Light Cube CY5 | Thermo Fisher | AMEP4656 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Light Cube DAPI | Thermo Fisher | AMEP4650 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Light Cube RFP | Thermo Fisher | AMEP4652 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Onstage Incubator | Thermo Fisher | AMC1000 | Accessory for EVOS FL Auto |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | Component of SH-SY5Y media |
| Flow cytometer | |||
| Flow cytometry analysis software | |||
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413302 | hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-038 | Component of both Factory and Macrophage media |
| HBSS | Lonza | BE 10-547F | Hank’s balanced salt solution for washing steps |
| Human recombinant BMP4 | Gibco | PHC9534 | Component of Embryoid Body media |
| Human recombinant IL-3 | Gibco | PHC0033 | Component of both Factory and Macrophage media |
| Human recombinant SCF | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Component of Embryoid Body media |
| Human recombinant VEGF | Gibco | PHC9394 | Component of Embryoid Body media |
| Live Cell Imaging Solution | Thermo Fisher | A14291DJ | Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys |
| Low protein binding 2 mL tubes | Eppendorf | 30108.132 | For staining SH-SY5Ys |
| M-CSF | Thermo Fisher | PHC9501 | Component of both Factory and Macrophage media |
| mTeSR1 Medium | STEMCELL Technologies | 85850 | iPSC media |
| Multichannel 20-200 uL pipette | For liquid handling of 96-well plate | ||
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher | R37605 | Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media. |
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | HH14000000 | High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9. |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media |
| pHrodo iFL Red STP-Ester | Thermo Fisher | P36011 | pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. |
| Serological pipette filler | |||
| T175 flask, tissue culture treated | Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories" | ||
| T75 flask | Vessel for SH-SY5Y culture | ||
| Transparent plate sealers | Greiner Bio-One | 676001 | For assay plate storage and transportation |
| TrypLE Express (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat. |
| Water bath, set to 37°C | |||
| X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red | Lonza | BE04-418F | Component of Factory and Macrophage media |
| X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red | Lonza | 04-744Q | Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors |
Referenzen
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Hall-Roberts, H., Di Daniel, E., James, W. S., Davis, J. B., Cowley, S. A. In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages. J. Vis. Exp. (168), e62217, doi:10.3791/62217 (2021).