JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biotechnik

Подготовка эмбрионов Chicken Ex Ovo и хориоаллантоидных мембранных сосудов в качестве модели in vivo для ультразвуковой визуализации с усилением контраста и исследований доставки лекарственных средств, опосредованных микропузырем

Published: February 09, 2021
doi:
10.3791/62076
, , , ,
1Department of Biomedical Engineering, Thoraxcenter,Erasmus MC University Medical Center Rotterdam, 2Laboratory of Acoustical Wavefield Imaging, Faculty of Applied Sciences,Delft University of Technology

Summary

Этот протокол описывает три метода получения и использования куриных эмбрионов в возрасте от 5 до 8 дней и их хориоаллантоической мембраны (CAM) в качестве модели in vivo для изучения ультразвуковой визуализации с усилением контраста и доставки лекарств, опосредованной микропузырем.

Abstract

Куриный эмбрион и богатая кровеносными сосудами хориоаллантоидная мембрана (CAM) являются ценной моделью in vivo для исследования биомедицинских процессов, новых схем ультразвуковой пульсации или новых преобразователей для контрастно-усиленной ультразвуковой визуализации и доставки лекарств, опосредованной микропузырем. Причинами этого являются доступность сети эмбрионов и сосудов CAM, а также низкая стоимость модели. Важным шагом для получения доступа к эмбриону и сосудам CAM является извлечение содержимого яиц из яичной скорлупы. В этом протоколе описаны три способа извлечения содержимого из яичной скорлупы между 5 и 8 днями инкубации, что позволяет эмбрионам развиваться внутри яичной скорлупы до наших дней. Описанные методы требуют только простых инструментов и оборудования и дают более высокую выживаемость 90% для 5-дневных, 75% для 6-дневных, 50% для 7-дневных и 60% для 8-дневных инкубированных яйцеклеток по сравнению с ex ovo культивируемыми эмбрионами (~ 50%). Протокол также описывает, как вводить кавитационные ядра, такие как микропузырьки, в сосудистую систему CAM, как отделить мембрану, содержащую эмбрион и CAM, от остального содержимого яйца для оптически прозрачных исследований и как использовать куриный эмбрион и CAM в различных краткосрочных ультразвуковых экспериментах. Модель куриного эмбриона in vivo и CAM чрезвычайно актуальна для исследования новых протоколов визуализации, ультразвуковых контрастных агентов и схем ультразвуковой пульсации для ультразвуковой визуализации с усилением контраста, а также для разгадки механизмов доставки лекарств, опосредованных ультразвуком.

Introduction

Эмбрионы ex ovo chicken и богатая кровеносными сосудами хориоаллантоидная мембрана (CAM) оказались подходящей моделью для исследования различных биологических и биомедицинских процессов, таких как эмбриогенез, онкология и доставка лекарств 1,2,3,4. Ультразвук использовался для визуализации эмбрионального развития сердца 4,5 и для активации кавитационных ядер при инъекции, таких как микропузырьки, для доставки сосудистых препаратов 6,7. Куриные эмбрионы недороги, требуют меньше инфраструктуры и оборудования и имеют менее строгое законодательство по сравнению с другими моделями животных8. Куриный эмбрион и сосуды CAM легко доступны после вскрытия яйцеклетки, тогда как это оказывается гораздо сложнее с эмбрионами и сосудами млекопитающих. Кроме того, куриный эмбрион и сосуды CAM обеспечивают сердцебиение и пульсирующий кровоток. CAM показывает сходство в анатомии сосудов с млекопитающими и может быть использован для скрининга лекарств 8,9,10. Из-за этих характеристик сосуды CAM также оказались подходящей моделью для исследования контрастной улучшенной ультразвуковой визуализации (CEUS) 11,12,13,14,15,16. Кроме того, модель может быть использована для оптического исследования поведения ультразвуковых контрастных веществ в ультразвуковом поле с помощью сверхскоростной камеры и влияния силы акустического излучения на движение, связывание и экстравазацию лекарств 7,17,18,19. Хотя куриный эмбрион и CAM менее подходят для долгосрочных экспериментов, они могут быть полезны для краткосрочных экспериментов in vivo.

Чтобы повысить видимость и контролируемость над куриным эмбрионом и CAM во время экспериментов, важно удалить содержание яиц, содержащих эмбрион и CAM, из яичной скорлупы18. Предыдущие исследования куриных эмбрионов с использованием ультразвуковых контрастных веществ использовали от 5 до 6-дневных эмбрионов 7,11,12,17,19 и от 14 до 18-дневных эмбрионов 13,14,15,16. Было подробно описано несколько подходов к извлечению содержания яиц из скорлупы 18,20,21. Однако, насколько нам известно, ранее опубликованные подходы сосредоточены на извлечении яичного содержимого из яичной скорлупы после 3 дней инкубации (например, Hamburger & Hamilton (HH) стадии 19-2022) и продолжении культуры ex ovo. Этот подход ex ovo culture имеет множество недостатков, включая повышенный риск смертельных исходов во время культивирования (~ 50%)1,18, использование антибиотиков 18,20 и уменьшение общей длины сосудов по сравнению с ростом ovo 23. Поскольку культивирование эмбриона в яичной скорлупе обеспечивает наиболее естественную среду, легче всего инкубировать эмбрион в яичной скорлупе до дня эксперимента. По этой причине подход, при котором содержание яиц извлекается из яичной скорлупы через 5-8 дней инкубации, был бы полезен, особенно для экспериментов на 5-8-дневных эмбрионах.

В этом протоколе мы описываем три метода извлечения содержимого яиц из яичной скорлупы, когда эмбрион находится на 5-8 дне развития (HH 26-3522), что позволяет эмбриону развиваться в яичной скорлупе до дня эксперимента. Размер сосуда CAM колеблется от 10-15 мкм в диаметре, в меньших капиллярах 8-дневного эмбриона24, до 115-136 мкм в диаметре в более крупном сосуде 6-дневных и 8-дневных эмбрионов 24,25. Три описанных метода требуют только базовых лабораторных инструментов и снижают риск осложнений до начала эксперимента, тем самым уменьшая ненужные затраты и трудозатраты. Мы также подробно описываем метод отделения мембраны, содержащей эмбрион и CAM, от желточного мешка, что делает CAM оптически прозрачным для микроскопических исследований. Поскольку мембрана, содержащая эмбрион и CAM, может быть закреплена, например, на держателе с акустической мембраной, установка также может быть сделана акустически прозрачной26, что позволяет сочетать микроскопию и ультразвуковые исследования, когда световой путь будет затронут желтком. Наконец, мы опишем несколько других ультразвуковых установок, которые можно использовать для ультразвука или визуализации CEUS.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Нидерландским законом об экспериментах на животных и в соответствии с Европейским советом (2010/63/EU) по защите использования животных в научных целях. 1 . Протокол подготовки эмбриона Инкубация оплодотворенных куриных яицХраните свежеоплодотворенные куриные яйца при температуре 15 °C в течение одной недели. Чтобы высиживать оплодотворенные яйца, поместите их вертикально заостренной стороной вниз в увлажненный инкубатор с температурой 37 °C. Переворачивать яйца во время инкубации не нужно.ПРИМЕЧАНИЕ: Напишите дату начала инкубации верхней части яйца с помощью перманентного маркера. Подготовка до 5-дневного (120 ч) старого эмбриона (стадия HH 26-28)22Подготовка рабочей зоныРазогрейте нагревательную пластину до 37 °C. Поместите металлический держатель для яиц (рисунок 1A, B), металлический держатель для взвешивания лодки (рисунок 1C, D) и 10 мл Erlenmeyer, наполненный PBS, на нагревательную пластину. Наполните весовую лодку (85 мм × 85 мм × 25 мм) слоем ультразвукового геля толщиной 10 мм и поместите заполненную весовую лодку в предварительно расплавленный металлический держатель для взвешивания.ПРИМЕЧАНИЕ: Заполнение весовой лодки ультразвуковым гелем поднимет эмбрион и CAM. Это может быть полезно для инъекции или визуализации эмбриона и CAM, но не обязательно для извлечения эмбриона и CAM из яичной скорлупы. Подготовьте несколько кусочков ленты (длиной около 3 см) с частью одного конца, сложенной обратно на себя, чтобы она больше не прилипала. Извлечение содержимого яиц из яичной скорлупыВозьмите 5-дневную инкубированную оплодотворенную яйцеклетку и перенесите ее в предварительно расплавленный металлический держатель яиц (рисунок 1A,B). Убедитесь, что яйцо находится в той же ориентации (т. Е. Дата сверху).ПРИМЕЧАНИЕ: Важно держать яйцо в той же ориентации, чтобы сохранить воздушный мешок и эмбрион и CAM в одном и том же положении в верхней части яйца. Используйте заостренную заднюю часть пинцета (или аналогичного; Рисунок 1E) сделать небольшой отступ в самом верху яйца (где написана дата) (рисунок 2А). Используйте заостренную заднюю часть пинцета, чтобы сделать второй отступ на стороне яйца около 2/3 вниз по яйцу (рисунок 2B).ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не сделать отступ слишком большим и не создать отверстие. Если случайно образовалось отверстие, заклейте отверстие скотчем и не делайте еще один отступ. Используя пинцет большего размера (рисунок 1E), выньте небольшой кусочек яичной скорлупы из вдавленной области поверх яйца (с указанием даты). Убедитесь, что воздушный мешок в верхней части яичной скорлупы вступает в контакт с воздухом снаружи яйца, но не проникайте в скорлупу слишком глубоко.ПРИМЕЧАНИЕ: Если оболочка проникает слишком глубоко при создании верхнего отступа, эмбрион и CAM могут быть повреждены, и эмбрион не переживет удаление из оболочки. Важно, чтобы небольшое отверстие сверху создавало воздушный контакт между внутренней и внешней частью яйца. Если этого не сделать, на следующих этапах процедуры будет создан вакуум, который приведет к тому, что большие пузырьки воздуха попадут в ловушку под CAM, что сделает эмбрион и CAM бесполезными. Чтобы проверить положение воздушного мешка внутри яйца, можно использовать источник света, так как его положение не всегда точно вверху, а также может быть больше в стороне. Используйте шприц 5 мл и иглу 19 г, чтобы проникнуть в скорлупу через второй отступ на стороне 2/3 вниз по яйцу и извлечь ~ 2 мл яичного белка (рисунок 2C).ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что игла направлена вниз к нижней части яйцеклетки, чтобы предотвратить вероятность повреждения эмбриона и CAM. Этот шаг создает больший воздушный карман в верхней части яйца, необходимый для удаления содержимого яйца. Если вместо отступа на этапе 1.2.2.3 случайно создается отверстие, проколите ленту иглой для извлечения яичного белка. Повторно запечатайте прокол еще одним куском ленты. Выньте иглу и используйте ленту, чтобы запечатать зазор сбоку (рисунок 2D).ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить утечку яичного белка из яйца, верхнее отверстие можно закрыть пальцем, прежде чем вынимать иглу. Если яичный белок продолжает вытекать с лентой уже на месте, сначала удалите яичный белок с кусочком ткани, чтобы убедиться, что лента прилипает правильно. Опорожните шприц, добавив яичный белок в весовую лодку. Используйте большой пинцет (рисунок 1E), чтобы увеличить небольшое отверстие в верхней части яйца (рисунок 2E). При взгляде внутрь яйцеклетки через отверстие сверху видны эмбрион и CAM. Продолжайте находить эмбрион и CAM, забирая как можно больше яичной скорлупы (рисунок 2F).ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте двигать яйцо, чтобы поддерживать максимальную видимость положения эмбриона и CAM внутри скорлупы. Убедитесь, что край отверстия в оболочке не опускается ниже CAM. Кроме того, не проникайте внутрь мембраны и не допускайте острых краев. После создания отверстия поверните яйцо на 180° и поместите яйцо обратно в держатель яйца таким образом, чтобы созданное отверстие в верхней части яйца теперь было обращено к низу. Эмбрион всплывет вверх и станет невидимым со дна (рисунок 2G), что займет 1-2 минуты. Убедитесь, что весь эмбрион и CAM (включая все сосуды) исчезли и виден только желток, прежде чем переходить к следующему шагу (рисунок 2H).ПРИМЕЧАНИЕ: Если эмбрион все еще виден со дна через 2 мин, поверните яйцо по часовой стрелке на 1-2 мин. Это поможет эмбриону и CAM всплыть вверх. Снимите ленту с бокового отверстия. Посмотрите, выпирает ли теперь внутренняя часть яйца из нижнего отверстия. Если это так, перейдите к следующему шагу. Если нет, используйте иглу на шприце, чтобы еще раз проколоть отверстие сбоку, чтобы освободить вакуум в яйцеклетке. Убедитесь, что игла указывает вверх, чтобы предотвратить вероятность прокола желточного мешка. Продолжайте до тех пор, пока яйцо не выпячится из нижнего отверстия. Удерживая дно яйца близко к весовой лодке в металлическом держателе весовой лодки (рисунок 1С,D), аккуратно, но быстро сделайте горизонтальную царапину в мембране по всей ширине отверстия, используя одну из острых точек малого пинцета (рисунок 1F) и осторожно опустите содержимое яйца в весовую лодку (рисунок 2I).ПРИМЕЧАНИЕ: Если содержимое яйца не выходит, используйте иглу на шприце, чтобы снова проколоть боковое отверстие иглой, направленной вверх. Если эмбрион находится в весовой лодке боком, он обычно поднимается сам по себе. Если этого не произошло, используйте лист папиросной бумаги, чтобы переместить эмбрион. Положите одну сторону папиросной бумаги на эмбрион, перетащите папиросную бумагу на другой конец и освободите папиросную бумагу несколькими каплями ~ 30 мкл PBS (37 ° C) с помощью пластиковой пипетки Пастера. Визуально проверьте, жив ли эмбрион, убедившись, что сердцебиение все еще присутствует, сосуды CAM неповреждены и нет кровотечения, и нет утечки желтка. Если одна из этих вещей неверна, отбросьте эмбрион и CAM, потому что он не будет жизнеспособным. Убедитесь, что эмбрион и CAM хранятся при 37 ° C и не высыхают, потому что это приведет к ухудшению сосудов CAM, и в конечном итоге эмбрион умрет. Чтобы предотвратить это, регулярно наносите небольшие капли ~30 мкл 37 °C PBS на эмбрион и CAM. Подготовка от 6 до 7 дней (144-168 ч) старого эмбриона (стадия HH 28-32)22Подготовка рабочей зоныПодготовьте этап, как описано в разделе 1.2.1. Извлечение содержимого яиц из яичной скорлупыЗа два часа до начала эксперимента возьмите инкубированное яйцо возрастом от 6 до 7 дней и поверните яйцо на 180° внутри инкубатора так, чтобы верхняя часть яйца была обращена к низу. Через 1 ч повернуть яйцо обратно в исходное положение и оставить еще на 1 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Вращение яйца за 2 ч до начала эксперимента облегчит извлечение содержимого яйца из скорлупы. После вращения возьмите яйцо из инкубатора. Выполните шаг 1.2.2.2 до шага 1.2.2.4. Используйте шприц объемом 5 мл и иглу 19 г, чтобы проникнуть в скорлупу через второй отступ на стороне 2/3 вниз по яйцу и извлечь от 5 до 6 мл яичного белка. Убедитесь, что игла направлена вниз на дно яйца.ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью шприца объемом 5 мл, который мы использовали, можно изъять до 6 мл, поэтому требуется только одно проникновение. Выньте иглу и используйте кусок ленты, чтобы запечатать зазор сбоку (рисунок 2D). Опорожните шприц, добавив яичный белок в ультразвуковой гель в весовой лодке. Используйте большой пинцет (рисунок 1E), чтобы увеличить небольшое отверстие в верхней части яйца (рисунок 2E). Постарайтесь сделать отверстие как можно большим, но убедитесь, что край отверстия в оболочке не опускается ниже CAM. Кроме того, не проникайте во внутреннюю мембрану и старайтесь не допускать острых краев. Заполните шприц на ~1 мл больше, чем на 37 °C PBS, чем изъятый объем на шаге 1.3.2.4. Снимите ленту с бокового зазора, проникните в щель заполненным шприцем и опустошите его в оболочку. Убедитесь, что игла направлена вниз на дно яйца.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку яичный белок имеет более высокую вязкость (~160 cP)27, чем PBS (~1 cP), замена яичного белка PBS снижает как напряжение, так и стресс на эмбрионе и CAM при извлечении содержимого яиц из скорлупы. Выньте иглу и быстро запечатайте зазор куском ленты (рисунок 2D). Поверните яйцо на 180° и поместите яйцо обратно в держатель яиц таким образом, чтобы созданное отверстие в верхней части яйца теперь было обращено к низу. Поворачивайте яйцо по часовой стрелке до тех пор, пока не исчезнет весь эмбрион и CAM (включая все сосуды) и не будет виден только желток. Выполните шаг 1.2.2.10 до шага 1.2.2.14. Подготовка 8-дневного (192 ч) старого эмбриона (стадия HH 32-35)22Подготовка рабочей зоныРазогрейте нагревательную пластину до 37 °C. Поместите металлический держатель для взвешивания лодки (рисунок 1C, D) и 10 мл Erlenmeyer, заполненный PBS, на нагревательную пластину. Возьмите неглубокий контейнер размером 170 x 110 x 70 мм или аналогичный и заполните контейнер 1 л 37 °C PBS. Поместите весовую лодку (85 × 85 × 25 мм) в чашку Петри диаметром 90 мм. Поместите чашку Петри и весовую лодку на дно контейнера и убедитесь, что они полностью погружены в воду. Извлечение содержимого яиц из яичной скорлупыЗа два часа до начала эксперимента возьмите 8-дневное инкубированное яйцо и поверните яйцо на 180° внутри инкубатора так, чтобы верхняя часть яйца была обращена к низу. Через 1 ч повернуть яйцо обратно в исходное положение и оставить еще на 1 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Вращение яйца за 2 ч до начала эксперимента облегчит извлечение содержимого яйца из скорлупы. Возьмите 8-дневное инкубированное яйцо из инкубатора. Держите яйцо горизонтально и используйте заостренную заднюю часть большого пинцета (рисунок 1E), чтобы сделать небольшой отступ 1/2 вниз по яйцу. Продолжайте делать небольшие углубления в кольцевом рисунке 360° вокруг яичной скорлупы. Используйте расстояние ~10 мм между отступами.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры между углублениями могут начать образовываться небольшие трещины. После создания небольших отступов вокруг оболочки сделайте одно большее отверстие, расколов оболочку между двумя небольшими отступами, используя заостренную заднюю часть большого пинцета. Полностью погрузите яйцо в 37 °C PBS и держите его под водой в течение 5 минут. Через 5 минут держите яйцо близко к весовой лодке внутри контейнера. Положите верхушку обоих больших пальцев в большое отверстие и аккуратно откройте яйцо. Яйцо будет трескаться вдоль небольших углублений. Когда трещина образуется вокруг яичной скорлупы, осторожно попытайтесь раздвинуть два кусочка яичной скорлупы и продолжайте осторожно перемещать два кусочка вперед и назад, пока содержимое яйца не отделится от скорлупы. Затем осторожно опустите содержимое яиц в весовую лодку.ПРИМЕЧАНИЕ: Перемещая два куска яичной скорлупы вперед и назад, больше PBS будет поступать в яичную скорлупу, что поможет отделить содержимое яйца от скорлупы. Иногда немного яичного белка прилипает к внутренней части яичной скорлупы. Когда это произойдет, используйте пинцет, чтобы отделить яичный белок от скорлупы. Медленно поднимите чашку Петри, содержащую весовую лодку и содержание яиц из PBS. Выйдя из PBS, слегка наклоните весовую лодку, чтобы удалить избыток PBS. Поместите весовую лодку, содержащую содержимое яиц, в металлический держатель весовой лодки и перейдите к нужной экспериментальной установке. 2. Избранные приложения Впрыскивание микропузырьков и/или других растворов в сосуды CAMПодготовка настройки впрыскаВытащите стеклянные иглы из стеклянных капиллярных трубок с помощью микрокузницы (рисунок 3А) или купите вытянутые стеклянные капиллярные иглы. В случае, если кончик стеклянной капиллярной иглы не скошен, отломите небольшую часть кончика иглы. Наполните стеклянную иглу минеральным маслом и поместите ее в систему микроинжекции. Убедитесь, что в минеральном масле в стеклянной игле нет пузырьков воздуха.ПРИМЕЧАНИЕ: Минеральное масло добавляется в соответствии с инструкцией производителя системы впрыска, которую мы использовали. Опорожните капиллярную иглу с вытянутым стеклом, насколько позволяет система микроинжекции, и частично наполните стеклянную иглу воздухом.ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой кусочек воздуха предотвратит смесь минерального масла и вводимого раствора. Нанесите 10 мкл нужного раствора, в этом протоколе микропузырьков, на кусок воскообразной пленки (рисунок 3В). Если требуется более одного раствора, растворы могут быть смешаны перед пипеткой7.ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем заполнять иглу микропузырьками, оставьте каплю микропузырька на восковой пленке в течение ~ 1 минуты, чтобы микропузырьки всплыли к вершине капли и сконцентрировались. Для ультразвукового контрастного веществаF-типа 28 эта стадия концентрации увеличит концентрацию микропузырьков для инъекций на ~ 30%. Концентрация после инъекции в крови куриного эмбриона будет составлять от 32 х 103 микропузырьков / мкл для 5-дневных эмбрионов и 19 х 103 микропузырьков / мкл для 6-дневных эмбрионов. Заполните стеклянную иглу микропузырем и/или другим раствором, расположив кончик стеклянной иглы в каплю на восковой пленке. При аспирации микропузырьков обязательно расположите кончик иглы в верхней части капли жидкости, чтобы аспирировать обогащенный микропузырем раствор.ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инъекцией микропузырьков поднимите кончик стеклянной иглы до самой высокой точки и подождите ~ 2 мин. Это гарантирует, что микропузырьки будут концентрироваться в кончике стеклянной иглы. Впрыскивание в сосуды CAMПеред инъекцией посмотрите на CAM под стереомикроскопом и выберите лучший сосуд для инъекции. Всегда вводите в одну из вен эмбриона. Это сосуды, в которых кровоток движется в сторону эмбриона. Вены светлее по цвету, чем артерии из-за насыщенной кислородом крови29. Кроме того, вены всегда находятся на вершине артерии с двумя исключениями, а именно передними и задними вителлиновыми венами (т. Е. Менее разветвленными венами, обозначенными звездочками на рисунке 6A, B), которые не имеют артерии в своем окружении.ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция в одну из ветвей ограничит обструкцию кровотока во время инъекции. Хорошие места инъекций были обозначены наконечниками стрел на рисунке 6A, B. Крайне важно ввести в вену, так как это заставит введенное вещество течь к эмбриону. Кроме того, инъекция в артерию приведет к массивному кровотечению при удалении стеклянной иглы, которая убьет эмбрион. Расположите стеклянную иглу и эмбрион таким образом, чтобы кончик стеклянной иглы и выбранная вена находились в одной фокальной плоскости и в одной линии направления. Постарайтесь расположить иглу как можно горизонтальнее параллельно выбранной вене. Кончик иглы должен касаться стенки сосуда.ПРИМЕЧАНИЕ: Если расположить стеклянную иглу как можно горизонтальнее, вероятность прокола всего сосуда снижается. После позиционирования медленно продвигайтесь и проникайте стеклянной иглой в стенку сосуда. Во время проникновения CAM сначала будет отталкиваться движением стеклянной иглы. Продолжайте продвигать стеклянную иглу до тех пор, пока стенка сосуда не будет пробита.ПРИМЕЧАНИЕ: Если случайно сосуд прокалывается насквозь, медленно втягивайте иглу, чтобы вернуться в просвет. Вернувшись внутрь просвета, слегка поднимите иглу вверх и двигайтесь вперед вдоль сосуда, чтобы переместить иглу. После проникновения слегка втяните стеклянную иглу, чтобы лучше расположить наконечник внутри просвета сосуда, и переместите стеклянную иглу вбок, чтобы убедиться, что она не прикреплена к стенке сосуда. Медленно вводят небольшое количество раствора, чтобы подтвердить, что наконечник расположен внутри просвета сосуда (рисунок 3C). Убедитесь, что введенный раствор следует за кровотоком. Если это не так, слегка переместите стеклянную иглу и продолжайте вводить небольшие количества, пока стеклянная игла не будет правильно расположена17. Когда нужное количество введено, оставьте стеклянную иглу в сосуде на ~ 15 с, чтобы предотвратить массивное кровотечение. Затем переместите стеклянную иглу немного вбок, вверх и вниз, а также вперед и назад несколько раз, чтобы позволить осторожно втянуть стеклянную иглу.ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые кровотечения являются нормальными. Для каждой инъекции используйте новую стеклянную иглу, потому что стеклянная игла легко забивается и тупоятся от яичного белка. Микроскопическая визуализация эмбриона и/или сосудов CAMДержатель для подготовки с акустической мембранойВозьмем камеру для культивирования клеток, состоящую из квадратного пластикового держателя с двумя параллельными акустически прозрачными поликарбонатными мембранами26 толщиной 50 мкм, далее именуемыми держателем с акустической мембраной. Закройте оба порта крышкой. Используйте скальпель, чтобы удалить одну из двух мембран с держателя с акустической мембраной.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удалить мембрану, отрежьте мембрану рядом с клеевой линией на пластике. Будьте осторожны, чтобы не соскользнуть с края, чтобы предотвратить повреждение другой мембраны. Приготовьте ~15 мл 2% агарозы в растворе полуводки, нагревая до 80-95 °C в небольшом стеклянном стакане. Охладите стеклянный стакан растворенным раствором агарозы под проточным краном холодной воды.ПРИМЕЧАНИЕ: Если агароза слишком горячая, она расплавит акустическую мембрану, что создаст неровную поверхность. Когда раствор остынет примерно до 37 °C, медленно налейте раствор в держатель с акустической мембраной, пока он не заполнит весь держатель. Слегка наклоните держатель акустической мембраной, чтобы слой агарозы равномерно распределился внутри пластиковой рамы (рисунок 4А). Убедитесь, что слой агарозы плоский, и пусть агароза устанавливается при комнатной температуре. Извлечение эмбриона и CAM из желточного мешка и размещение на держателе с акустической мембранойИзвлеките из яйца содержимое яйца, как описано в разделах 1.2, 1.3 или 1.4. При необходимости вводите в КАМ микропузырьки и/или другой раствор(ы), как описано в разделе 2.1.2. Наполните чашку Петри объемом 1 л ~500 мл 37 °C PBS и поместите держатель с акустической мембраной с агарозой на дно чашки. Убедитесь, что слой агарозы обращен вверх. Используйте небольшие ножницы, чтобы быстро врезать мембрану желточного мешка, также называемого мембраной Vitellus, вокруг всего CAM, пока содержание яиц находится в весовой лодке (рисунок 4B). Держите ножницы в том же положении и вращайте весовую лодку во время резки для большей точности и большей скорости.ПРИМЕЧАНИЕ: С момента первого разреза желток начнет протекать. Это снижает видимость эмбриона и CAM. Попробуйте разрезать весь путь вокруг CAM в течение 6-7 разрезов. Это не должно занять много времени, чем 20 с. Небольшой пинцет (рисунок 1F) может быть использован для удержания края вителлиновой мембраны и предотвращения разрезания CAM. Используйте столовую ложку, чтобы зачерпнуть вырезанную мембрану, содержащую эмбрион и CAM, из весовой лодки. Медленно поднимите ложку из весовой лодки и визуально проверьте, прикреплена ли вырезанная мембрана, содержащая эмбрион и CAM, к оставшейся мембране желточного мешка. Когда это так, используйте ножницы, чтобы сделать дополнительный разрез. Во время зачерпывания слегка наклоните ложку, чтобы избавиться от как можно большего количества желтка, но не дайте ему высохнуть. Перенесите вырезанную мембрану, содержащую эмбрион и CAM, в чашку Петри объемом 1 л, погрузите в PBS при температуре 37 °C и удалите ложку. Когда мембрана, содержащая эмбрион и CAM, погружается в 37 °C PBS, используйте небольшие пинцеты (рисунок 1F), чтобы захватить один край мембраны и осторожно вращаться вокруг мембраны, чтобы избавиться от желтка, который все еще прикреплен. Когда весь желток будет удален, используйте небольшой пинцет, чтобы переместить мембрану, содержащую эмбрион и CAM, и расположить ее над держателем с акустической мембраной. Используйте один образец насекомого, чтобы закрепить мембрану, содержащую эмбрион и CAM, в одном углу. Избегайте прокалывания сосудов в CAM и только зафиксируйте мембрану. Используйте второй штифт образца насекомого, чтобы закрепить мембрану, содержащую эмбрион и CAM, на диагонально противоположном углу. Медленно поднимите держатель с помощью акустической мембраны, содержащей эмбрион и CAM, от PBS 37 °C. Слегка наклоните держатель, чтобы избавиться от большей части PBS. Используйте небольшой пинцет (рисунок 1F), чтобы растянуть и равномерно распределить мембрану, содержащую эмбрион и CAM, по держателю с помощью акустической мембраны и закрепить остальную часть мембраны. Убедитесь, что мембрана, содержащая эмбрион и CAM, слегка растянута, чтобы убедиться, что она плоская (рисунок 4C). Поместите держатель с акустической мембраной с закрепленной мембраной, содержащей эмбрион и CAM, в микроскопическую установку, которая поддерживается при 37 °C. Поместите крышку или акустически и оптически прозрачную мембрану (в зависимости от желаемого объектива и использования ультразвука или нет) поверх интересующей области эмбриона или CAM (рисунок 4D), чтобы обеспечить оптическую визуализацию. Ультразвуковая визуализация куриного эмбриона и/или СОСУДОВ CAMУльтразвуковая визуализация со стороны куриного эмбриона и сосудов CAMИзвлеките содержание яиц, как описано в разделах 1.2, 1.3 или 1.4. Однако не используйте стандартную весовую лодку. Вместо этого используйте изготовленную на заказ весовую лодку с одной акустически прозрачной стеной.ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная весовая лодка была отрегулирована путем отсечения одной стороны весовой лодки и замены ее окном из полиэфирной фольги, которое было склеено с использованием эпоксидного клея. Погрузите предпочтительный ультразвуковой преобразователь в водяную баню с температурой 37 °C и расположите в нужном месте с требуемым расстоянием стояния. Поместите весовую лодку на водяную баню таким образом, чтобы прозрачная стенка была обращена к преобразователю. Убедитесь, что весовая лодка достаточно глубока, чтобы быть на одном уровне с датчиком, но избегайте попадания воды в весовую лодку (рисунок 5A). При желании добавьте еще одну установку к верхней части эмбриона или сосудов CAM, например, микроскоп или лазер (рисунок 5A). Ультразвуковая визуализация сверху эмбриона и сосудов CAM без акустических помехНаполните стакан объемом 2 л с 37 °C PBS. Поместите стакан емкостью 500 мл вверх ногами на дно 2-литрового стакана. Избегайте воздуха внутри стакана емкостью 500 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Стакан емкостью 500 мл предназначен для поднятия весовой лодки, содержащей содержание яиц, ближе к поверхности PBS. Заменяя стакан на объекты других размеров, расстояние между датчиком и содержимым яиц можно варьировать. Поместите наполненный 2-литровый стакан с стаканом 500 мл внутрь на водяной бане с температурой 37 °C. Извлеките содержание яиц, как описано в разделах 1.2, 1.3 или 1.4. Смочите содержание яиц с 37 °C PBS и покройте эмбрион прозрачной пищевой пленкой. Это можно сделать, чтобы удержать эмбрион в том же положении и предотвратить его вращение или уплыв.ПРИМЕЧАНИЕ: Смачивая содержание яиц PBS, оно станет менее липким, что облегчит покрытие содержимого яйца прозрачной пищевой пленкой. Поместите весовую лодку с содержанием яиц в чашку Петри диаметром 90 мм и медленно погрузите чашку Петри в PBS (рисунок 5B).ПРИМЕЧАНИЕ: Использование двух зажимов по бокам чашки Петри, противоположных друг другу, облегчает погружение чашки Петри. Расположите ультразвуковой преобразователь на нужном расстоянии стояния. Ультразвуковая визуализация куриного эмбриона и СОСУДОВ CAM с помощью подвижного преобразователяИзвлеките содержание яиц, как описано в разделах 1.2, 1.3 или 1.4. Приготовьте 2% раствор агарозы в полуводье, нагревая раствор до 80-95 °C в небольшом стеклянном стакане. Охладите стеклянный стакан растворенным раствором агарозы под проточной таблеткой холодной воды. Перелейте раствор агарозы в плоский контейнер, чтобы создать агарозную прокладку толщиной около 1 мм. Когда полностью остынет и установится, вырежьте агарозную подушечку до нужного размера с помощью скальпеля.ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина агарозной прокладки может быть изменена для получения желаемого фокального расстояния, необходимого для правильного функционирования ультразвукового преобразователя. Поместите подушечку агарозы поверх эмбриона и CAM (рисунок 5C). Добавьте несколько капель ~ 30 мкл 37 °C PBS на верхнюю часть агарозной прокладки, чтобы создать тонкий слой PBS между агарозной прокладкой и преобразователем.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование PBS предотвратит прилипание датчика к агарозной прокладке. Это полезно при, например, использовании двигателя для механического перемещения двумерного преобразователя для выполнения трехмерного сканирования (рисунок 9B)11. Когда датчик не нужно перемещать, PBS также можно заменить ультразвуковым гелем. Установите нужный ультразвуковой преобразователь.

Representative Results

В этом протоколе мы описываем три способа извлечения содержимого яиц из скорлупы на 5-8 день инкубации (HH 26-3522). На рисунке 6 показано содержание яиц в весовых лодках после того, как оно было извлечено из скорлупы. 5-дневный эмбрион и CAM (рисунок 6A) были удалены с использованием метода, описанного в разделе 1.2. 6 и 7-дневные эмбрионы и CAM (рисунок 6B,C) были удалены с использованием метода, описанного в разделе 1.3. 8-дневный эмбрион и CAM (рисунок 6D) были удалены с использованием метода, описанного в разделе 1.4. Кровотечение или повреждение эмбриона или CAM не может наблюдаться, что указывает на то, что эти методы могут быть использованы для безопасного извлечения содержимого яиц из скорлупы без вреда для эмбриона или сосудов CAM. При правильном выполнении метод для 5-дневных эмбрионов обеспечит жизнеспособный эмбрион и интактный CAM в 90% всех процедур. Показатель жизнеспособности основан на общем количестве оплодотворенных яйцеклеток, успешно извлеченных из яичной скорлупы. При втором методе, для 6 и 7-дневных инкубированных яиц, вероятность жизнеспособного эмбриона и интактного CAM составляет около 75% для 6-дневных и около 50% для 7-дневных. С третьим методом, описанным для 8-дневных эмбрионов, вероятность жизнеспособного эмбриона и интактного CAM составляет около 60%. Можно наблюдать различия в стадиях развития между 5 и 8-дневными эмбрионами, что согласуется с Гамбургером и Гамильтоном22. Как размер эмбриона, так и сложность сосудов CAM увеличиваются во время развития (рисунок 6A-D).. На рисунке 6C показан тонкий участок агарозы поверх содержимого яйцеклетки, который позволяет визуализировать эмбрион и CAM с помощью ультразвуковой установки, показанной на рисунке 5C. После того, как содержимое яйца извлечено из скорлупы, сердцебиение эмбриона видно невооруженным глазом. Частота сердечных сокращений этих эмбрионов ex ovo аналогична частоте сердечных сокращений у эмбрионов ovo при 183 ударах в минуту (уд/мин) на 5-й день до ~208 уд/мин на8-30-й день. При увлажнении и при 37 °C эмбрион будет поддерживать эту частоту сердечных сокращений в течение ~ 5 ч в экспериментальных ультразвуковых установках. Множественные осложнения могут возникнуть во время ранее описанных трех методов. На рисунке 7А показан захваченный воздух под CAM, что делает эмбрион непригодным для ультразвуковой визуализации, и давление пузырька (пузырьов) воздуха также может повредить эмбрион и / или CAM. Эта проблема возникает, когда воздушный мешок внутри скорлупы не вступает в контакт с воздухом снаружи скорлупы при извлечении содержимого яйца из скорлупы. На рисунке 7B показана небольшая утечка желтка из желточного мешка в правом верхнем углу изображения. Это может произойти при извлечении содержимого яиц из скорлупы, когда желточный мешок повреждается острыми краями скорлупы или когда желточный мешок проникает пинцетом. Утечка желтка может повлиять на видимость эмбриона и сосудов CAM. На рисунке 7C показан эмбрион, в котором пузырь воздуха захвачен под CAM. Это иногда происходит в эмбриональном развитии. Еще одним осложнением, которое может возникнуть, является повреждение сосудов. Это повреждение может быть создано при извлечении содержимого яйца из скорлупы или при выполнении инъекции (рисунок 7D). Кроме того, эмбрион и сосуды также могут со временем высыхать (рисунок 7E). Это происходит, когда содержимое яиц не посыпается PBS. Высыхание эмбриона может привести к массивным капиллярным препятствиям (рисунок 7F), что влияет на жизнеспособность эмбриона. Массивные капиллярные препятствия также могут возникать во время развития или когда сердцебиение эмбриона неустойчиво. После того, как содержимое яйца извлечено из скорлупы без каких-либо осложнений, эмбриону можно вводить, например, ультразвуковые контрастные вещества, такие как микропузырьки (рисунок 3C). На рисунке 8 показаны циркулирующие микропузырьки в просвете кровеносного сосуда при инъекции. Эти микропузырьки переносятся вместе с кровотоком и присутствуют в кровообращении в течение нескольких часов (Дополнительное видео 1). Наличие этих микропузырьков в циркуляции создает возможность для выполнения различных типов CEUS и экспериментов по доставке лекарств 7,11,12. CAM идеально подходит для исследования новых методов обнаружения ультразвукового контраста, для которых мы показываем три примера. На рисунке 9А показана высокочастотная ультразвуковая субгармоническая визуализация 6-дневного куриного эмбриона в B-режиме и CEUS до и после инъекции микропузырька. Здесь сосудам CAM вводили 5 мкл ультразвукового контрастного вещества, а визуализацию выполняли с помощью доклинического ультразвукового аппарата животных с зондом MS250 (частота передачи 30 МГц и приема 15 МГц, мощность 10%). До инъекции микропузырька контраст уже можно увидеть внутри эмбрионального сердца на изображениях B-Mode (рисунок 9A-I). Это явление обусловлено наличием в птичьем эритроците ядра, которое увеличивает контраст крови при ультразвуковой визуализации 5,31. Добавление микропузырьков увеличило контрастность и видимость эмбриона, как в B-режиме, так и в визуализации CEUS. На рисунке 9B показано оптическое и высокочастотное 3D-субгармоническое изображение 6-дневного эмбриона и окружающих сосудов. CAM вводили 5 мкл ультразвукового контрастного вещества и проводили визуализацию с помощью доклинического ультразвукового аппарата животных с зондом MS550s (частота пропускания 40 МГц, пиковое отрицательное давление ~ 300 кПа). Эти результаты показывают, что визуализация CEUS в сочетании с контрастным веществом также может быть использована для создания высокочастотных 3D-субгармонических изображений и для изображения кровеносных сосудов за пределами эмбриона. На рисунке 9C показано оптическое изображение и ультрагармоническое внутрисосудистое ультразвуковое изображение (IVUS), сделанное с помощью специального зонда микрососудов CAM 6-дневного эмбриона (26 МГц и частота приема 39 и 65 МГц). Сосудам CAM вводили 4 ± ультразвукового контрастного вещества объемом 1 мкл. Оптическое изображение и изображение IVUS взяты из одного и того же эмбриона и одной и той же области интереса, показывающей соответствующие сети сосудов. Куриный эмбрион и сосуды CAM также могут быть использованы для исследования доставки лекарств, опосредованной ультразвуком, для чего мы показываем один пример. Поскольку желток препятствует световому пути во время визуализации, удаление желточного мешка необходимо для оптического исследования доставки лекарств в сосуды эмбриона и CAM. Для этого исследования эмбрион и CAM были подготовлены для микроскопической визуализации, как описано в разделе 2.2, путем отделения мембраны, содержащей эмбрион и CAM, от желточного мешка (рисунок 4C). У этих эмбрионов частота сердечных сокращений стабильна около 80 уд/мин, и эмбрионы остаются живыми до 2 ч при температуре 37 °C7. На рисунке 10 показано ультразвуковое и микропузырьковое опосредованное исследование доставки лекарственного средства в эндотелиальные клетки сосудов CAM. Микропузырьки с липидным покрытием, нацеленные на стенку сосуда с использованием αvβ3-антител и окрашенные флуоресцентным красителем DiI7, вводили в сосуды CAM (рисунок 10A, C). Ядра эндотелиальных клеток сосудов CAM окрашивали Hoechst 33342 (рисунок 10B), а для визуализации сонопорации7 использовали модельный препарат Propidium Iodide (PI). Оба этих красителя вводились одновременно с микропузырьками. При ультразвуковой обработке (1 МГц, пиковое отрицательное давление 200 кПа, одиночный всплеск из 1000 циклов) поглощение ПИ наблюдалось в ядрах, ближайших к целевым микропузырькам (рисунок 10D). Это показывает, что ультразвуковые колебания целевых микропузырьков смогли создать пору в мембране эндотелиальных клеток. Рисунок 1. Оборудование для подготовки эмбрионов. (А-Б) вид сверху и сбоку металлического держателя для яиц и вид сверху и сбоку ( C-D) металлического держателя для взвешивания лодки. Пинцет (E-F) необходим для извлечения содержимого яиц из скорлупы. Масштаб в см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2. Процедура удаления эмбриона. (A) Небольшой отступ в верхней части яйца, обозначенный черным кругом. (B) Небольшой отступ 2/3 вниз по яйцу, обозначенный черным кругом. (C) Изъятие ~2 мл яичного белка. (D) Герметичный зазор сбоку с помощью ленты. (E) Увеличение небольшого отверстия в верхней части яйца. (F) Эмбрион становится видимым после удаления части оболочки. (Г-Н) После поворота яйцеклетки на 180° эмбрион всплывает вверх и становится невидимым (стрелки указывают направление движения эмбриона). Через 1-2 мин эмбрион становится невидимым со дна. I) После расчесывания мембраны содержимое яиц падает в весовую лодку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3. Инъекция микропузырьков в сосуды CAM. (A) Стеклянная капиллярная игла. Накипь в см. (В) растворе пропидия йодида (ПИ) (левая капля) и микропузырьках (правая капля) перед аспирацией перед инъекцией. Иглу (очерченную черным цветом) можно увидеть в правом верхнем углу (C) Microbubble injection. Кончик капиллярной иглы расположен внутри просвета одной из вен (слева). Микропузырьки, белое облако, обозначенное стрелкой, вводятся и рассеиваются вслед за кровотоком (справа). Шкала представляет 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4. Извлечение эмбриона и КАМ из желточного мешка и помещение на держатель с акустической мембраной. (A) Держатель с акустической мембраной, заполненной агарозным слоем. (B) Куриный эмбрион и сосуд CAM в весовой лодке перед разделкой. Пунктирная линия указывает на линию разреза вокруг CAM. (C) Куриный эмбрион и CAM отделяют от желтка и прикрепляют к акустической мембране. (D) Закрепленный куриный эмбрион с акустически и оптически прозрачной мембраной в держателе (синем), помещенном поверх CAM. Держатель может быть заполнен полуводостью, поэтому можно использовать цель для погружения в воду. Все шкалы представляют 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5. Различные установки для эмбриона курицы и ультразвуковой визуализации CAM. (A) Настройка для ультразвуковой визуализации сбоку. Куриный эмбрион помещали в специально настроенную весовую лодку с одной акустически прозрачной стенкой и помещали в водяную баню с температурой 37 °C. Ультразвуковой преобразователь был расположен на левой (а) стороне рядом с акустически прозрачной стенкой, а лазер (б) для фотоакустической визуализации сверху. (B) Настройка для ультразвуковой визуализации сверху. Эмбрион и CAM были погружены в стакан PBS, который был помещен в водяную баню с температурой 37 °C. Пунктирная очертания показывает стеклянный стакан (а) объемом 2 л со стеклянным стаканом (б) объемом 500 мл внутри. (C) Установка для ультразвуковой визуализации сверху с подвижным преобразователем. Тонкую агарозную прокладку (пунктирную линию) помещали поверх эмбриона с тонким слоем PBS в качестве связи между преобразователем и поверхностью агарозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6. Содержание яиц вне скорлупы. (A) Содержание яиц, извлеченных из скорлупы после 5 дней инкубации. Указываются хориоаллантоическая мембрана (CAM), тело эмбриона (EB), передние и задние вителлиновые вены (*) и соответствующие места для инъекций (наконечники стрел). (B) Содержание яиц, извлеченных из скорлупы после 6 дней инкубации. Показаны передние и задние вителлиновые вены (*) и соответствующие места для инъекций (наконечники стрел). (C) Содержание яиц, извлеченных из скорлупы после 7 дней инкубации. Пластырь агарозы помещается сверху, чтобы обеспечить ультразвуковую визуализацию. Углы агарозного пятна обозначены черными кругами. D) Содержание яиц, извлеченных из скорлупы после 8 дней инкубации. Все шкалы представляют 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 7. Осложнения, которые могут возникнуть во время процедур с куриным эмбрионом и моделью CAM. (A) Пузырьки воздуха, захваченные под CAM при извлечении содержимого яиц из скорлупы с использованием метода 1.2 (5-дневный эмбрион) или 1.3 (эмбрион в возрасте от 6 до 7 дней). (B) Небольшая утечка желтка, обозначенная стрелкой в правом верхнем углу (6-дневный эмбрион). (C) Воздух, захваченный под CAM, обозначенный черным пунктирным кругом (7-дневный эмбрион). (D) Кровотечение, обозначенное черными стрелками (5-дневный эмбрион. (E) Высохший эмбрион и CAM (5-дневный эмбрион). (F) Массивные капиллярные обструкции (5-дневный эмбрион). Все шкалы представляют 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 8. Микропузырьки в кровеносных сосудах CAM. Стенка сосуда обозначена пунктирной линией, а одиночные микропузырьки обозначены стрелками. Шкала представляет собой 20 мкм. Соответствующую запись микроскопии можно найти в Дополнительном видео 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 9. Контрастно-усиленная ультразвуковая визуализация у куриных эмбрионов и сосудов CAM. (A) Проекция максимальной интенсивности B-Mode (I, III) и субгармонических (II, IV) изображений в реальном времени (доклинический ультразвуковой аппарат животных с зондом MS250, 30 МГц и приемная частота 15 МГц, мощность 10%) 6-дневного эмбриона с участком агарозы сверху. Верхние изображения (I, II) показывают результаты до и нижние (III, IV) после инъекции ультразвукового контрастного вещества объемом 5 мкл. Шкала представляет собой 1 мм. Это изображение было изменено с разрешения Daeichin et al. 201511 (B) Оптическая (слева) и 3D-субгармоническая визуализация (справа) 6-дневного куриного эмбриона с участком агарозы сверху. Сосудам CAM вводили ультразвуковое контрастное вещество объемом 5 мкл и проводили визуализацию высокочастотным зондом (доклинический ультразвуковой аппарат животных с зондом MS550s, частота пропускания 40 МГц, пиковое отрицательное давление ~ 300 кПа, визуализированный в доклиническом ультразвуковом аппарате животных 3-D режиме). Шкала представляет собой 5 мм. Это изображение было изменено с разрешения Daeichin et al. 201511. (C) Оптическое изображение (слева) и проекция средней интенсивности ультрагармонического внутрисосудистого ультразвука (IVUS) (справа) микроциркуляторного русла CAM 6-дневного эмбриона. Сосудам CAM вводили 4 ± 1 мкл контрастного вещества. Ультрагармоническая визуализация IVUS была выполнена с помощью специального датчика IVUS (частота передачи 35 МГц, пиковое отрицательное давление 600 кПа). Оба изображения сделаны из одного и того же эмбриона и области интереса. Стрелки указывают на соответствующие сосуды на двух изображениях. Шкала представляет собой 1 мм. Это изображение было изменено с разрешения Maresca et al. 201412. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 10. Доставка препарата к эндотелиальным клеткам сосуда CAM у 6-дневного эмбриона. (A) Изображение Брайтфилда шести αvβ3-целевых микропузырьков, обозначенных белыми стрелками, прилипшими к стенке сосуда перед ультразвуковым лечением. (B) Ядра эндотелиальных клеток флуоресцентно окрашиваются перед ультразвуковым лечением. (C) Флуоресцентное изображение окрашенных целевых микропузырьков, обозначенное белыми стрелками, перед ультразвуковым лечением. (D) Поглощение модельного лекарственного препарата пропидия йодида (PI) в клеточные ядра под целевыми микропузырьками после ультразвуковой обработки (1 МГц, пиковое отрицательное давление 200 кПа, одиночный всплеск 1000 циклов). Шкала представляет собой 10 мкм и применяется ко всем изображениям. Это изображение было изменено с разрешения Skachkov et al. 20147. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ФАЙЛЫ Дополнительное видео 1. Микропузырьки в кровеносных сосудах CAM. Шкала представляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Discussion

Этот протокол описывает три метода получения и использования куриных эмбрионов в возрасте от 5 до 8 дней и их CAM в качестве модели in vivo для изучения ультразвуковой визуализации с усилением контраста и доставки лекарств, опосредованной микропузырем. Наиболее важными шагами для извлечения 5-дневных (раздел 1.2) и 6-7-дневных (раздел 1.3) эмбрионов из скорлупы являются: 1) сделать небольшое отверстие в верхней части яйца, чтобы пройти через всю яичную скорлупу в воздушный мешок перед извлечением яичного белка; 2) создать гладкие края для большого отверстия в оболочке. Для метода извлечения 8-дневных эмбрионов из скорлупы (раздел 1.4) наиболее важными шагами являются: 1) Сделать достаточное количество углублений для создания красивой трещины вдоль яйца; 2) Держите яйцо погруженным в PBS. Для обеспечения жизнеспособности эмбриона для всех методов важно держать яйцеклетку и ее содержимое при 37 °C. Кроме того, избегайте инъекций в CAM-артерию. Визуальный контроль частоты сердечных сокращений эмбриона во время исследований рекомендуется для обеспечения жизнеспособности эмбриона. Для подтверждения точной стадии развития эмбриона может быть использована индикация Hamburger & Hamilton22.

Важно предотвратить повреждение эмбриона, КАМ и желточного мешка. Это повреждение может повлиять на жизнеспособность, кровоток и видимость эмбриона и CAM. Кроме того, повреждение желточного мешка и, следовательно, низкая жесткость мембраны делает инъекцию в сосуды CAM невозможной. 5-дневный эмбрион имеет относительно небольшой воздушный мешок, поэтому, чтобы иметь возможность сделать достаточно большое отверстие в скорлупе, через которое можно удалить содержимое яйца, необходимо изъять 2 мл яичного белка. В результате создается больше пространства между яичной скорлупой и эмбрионом. После изъятия яичного белка кусочек ленты нужно закрыть отверстие, куда вошла игла. Если яичный белок все-таки вытекает, нанесите еще один кусочек скотча. Кроме того, нанесение ленты на отверстие сбоку создает вакуум внутри яйца, который предотвращает выпадение содержимого яйца из-за собственного веса, когда большое отверстие создается на этапе 1.2.2.8. Повреждение эмбриона или CAM также может произойти, когда край яичной скорлупы был слишком острым или когда содержимое яйца опускается в весовую лодку слишком строго, поэтому яичную скорлупу следует держать очень близко к весовой лодке. Между 5 и 6 днем развития CAM начинает прикрепляться к мембране оболочки32. Это прикрепление увеличивает риск повреждения эмбриона и CAM при извлечении содержимого яйца из яичной скорлупы. Открывая яйцо после инъекции PBS в него для 6-7-дневного инкубированного яйца или в контейнере, наполненном PBS, как описано для 8-дневного инкубированного яйца, риск повреждения снижается. Что касается инъекции в вену CAM: если первая инъекция не удается, вторая инъекция может быть сделана далее вверх по течению в той же вене, если повреждение было незначительным или в другой вене CAM. Отделение эмбриона и CAM от желтка делает эмбрион и сосуды CAM оптически прозрачными. Как следствие, эмбрион теряет свой первичный источник питательных веществ33. Эта потеря питательных веществ может быть объяснением наблюдаемой более низкой частоты сердечных сокращений в 80 уд/мин по сравнению с ~ 190 для 6-дневного эмбриона, который все еще находится в контакте с желтком30, и уменьшенного времени выживания через 2 ч после этой процедуры разделения. Другим фактором, который может играть роль в снижении частоты сердечных сокращений и времени выживания, является задача сохранить разделенный желтком эмбрион и сосуды CAM при 37 ° C. Может быть полезен инкубатор ступени микроскопа. В дополнение к этому, отделение CAM от желтка, вероятно, приводит к механическим изменениям в ткани, поскольку напряжение мембраны становится меньше. Более низкое напряжение мембраны может вызвать увеличение скорости сдвига внутреннего сосуда, что приводит к снижению частоты сердечных сокращений.

Эмбрион ex ovo chicken и сосуды CAM имеют некоторые ограничения в качестве модели in vivo, включая только краткосрочные наблюдения, для контрастной усиленной ультразвуковой визуализации и исследований доставки лекарств, опосредованных микропузырем. Из-за небольшого объема крови 100±23 мкл на 5-й день и 171±23 мкл на6-34-й день можно вводить максимальный объем ~5 мкл. На поздних стадиях развития (7 день и старше) повышается жесткость сосудов и снижается эластичность желтка. Это может осложнить успешную инъекцию в более старые эмбрионы. Как только микропузырьки введены, они циркулируют в течение нескольких часов, потому что куриный эмбрион не имеет полностью развитой иммунной системы на этой стадии35. Таким образом, микропузырьки не очищаются в течение ~ 6 мин, как у людей36,37, что делает типичные ультразвуковые исследования молекулярной визуализации с периодом ожидания 5-10 минут для очистки несвязанных целевых микропузырьков38 невозможно. Для нацеливания на микропузырьки необходимо использовать подходящие лиганды, способные связываться с птичьими эндотелиальными клетками, как описано ранее для маркера ангиогенеза αvβ37. Другими аспектами, которые следует учитывать для этой модели, являются повышенная сложность отделения эмбриона и сосудов CAM от желтка у более старых эмбрионов (> 8 дней) и более низкий гематокрит ~ 20%39 по сравнению с людьми. Последние могут влиять на колебания микропузырьков, поскольку известно, что колебания микропузырьков затухают в более вязкой среде40. Артерии CAM менее насыщены кислородом, чем CAM-вены41,42. Это различие следует учитывать при, например, при изучении фотоакустической визуализации оксигенации крови.

Методы, описанные здесь, позволяют извлекать содержание яиц из яичной скорлупы в день ультразвуковой визуализации или исследования доставки лекарств, как правило, на 5-8 день инкубации. Это отличается от существующих методов, где содержание яиц извлекается из скорлупы после 3-дневной инкубации и далее развивается как ex ovo культура 18,20,21. Преимуществами являются более высокая выживаемость 90% для 5-дневных, 75% для 6-дневных, 50% для 7-дневных и 60% для 8-дневных инкубированных яиц по сравнению с ~ 50% для 3-дневных эмбрионов, извлеченных из яичной скорлупы и дополнительно инкубированных ex ovo 1,18 избегание антибиотиков во время посева 18, 20 и большой стерильный инкубатор для культуры ex ovo. Выживаемость эмбрионов в возрасте от 6 до 8 дней ниже, потому что CAM начинает прикрепляться к оболочке21, что делает мембрану CAM более склонной к разрыву при экстракции. Разделение эмбриона с CAM-формой желтка также описано, что делает эмбрион и CAM оптически прозрачными.

Размещая содержание яиц в различных установках, куриный эмбрион и CAM могут быть использованы для множества ультразвуковых исследований, таких как IVUS, фотоакустических, без или с ультразвуковыми контрастными агентами в 2D и 3D. Основное внимание может быть уделено разработке новых схем ультразвуковой пульсации или тестированию новых преобразователей. Кроме того, модель также может быть использована для исследования новых ультразвуковых контрастных веществ и их поведения в кровеносных сосудах под потоком. Поскольку механизм доставки лекарств, опосредованных микропузырем, до сих пор неизвестен43, использование модели IN VIVO CAM может помочь в выяснении механизма путем изучения поведения микропузырька по отношению к клеточному ответу. Наконец, сосуды CAM оказались подходящей системой для исследования трансплантации опухоли ксенотрансплантата44. Это создает возможность использовать сосуд CAM в качестве модели для исследования визуализации опухоли с помощью ультразвука и для исследования кровотока внутри опухоли с помощью CEUS. Опухоли обычно пересаживают на СОСУДы CAM 8-ти или 9-дневных эмбрионов 1,14,45, для которых эмбрион извлекается из яичной скорлупы на 3-й день инкубации и далее развивается ex ovo. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть использованы для выращивания эмбрионов в ово до дня пересадки опухоли.

Авторы полагают, что эта статья будет полезна для исследователей, которые хотят использовать куриные эмбрионы и их хориоаллантоическую мембрану (CAM) в качестве модели in vivo для применения контрастных веществ и исследований потока.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Прикладными и инженерными науками (TTW) (Vidi-project 17543), входящими в состав НМП. Авторы хотели бы поблагодарить Роберта Берскенса, Лукси Вэя и Резу Пакдамана Зангабада из Департамента биомедицинской инженерии и Михиэля Мантена и Герта Спрингелинга из Департамента экспериментального медицинского приборостроения за техническую помощь, все из Медицинского центра Университета Эразмус МС Роттердам, Нидерланды.

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A9539
Clamp (Kocher clamp)
Cling film
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2) MABIO, Tourcoing, France CLINIcell25-50-T FER 00106
Demi water
Disposable plastic Pasteur pipets VWR 612-1747
Eggs Drost Pluimveebedrijf Loenen BV, the Netherlands Freshly fertilized
Fridge 15 °C
Glass capillary needles Drummond 1-000-1000 Inside diameter: 0.0413 inch
Heating plate 37 °C
Humidified incubator 37 °C
Insect specimen pins
Metal egg holder Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B
Metal weighing boat holder Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D
Microinjection system FUJIFILM VisualSonics
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-100ML
Needle, 19 G VWR (TERUMO) 613-5392
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1x ThermoFisher 10010023
Petri dish, 1 L Glass
Petri dish, 90 mm diameter VWR 391-0559
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100) FUJIFILM VisualSonics
Probe (MS250) FUJIFILM VisualSonics 30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency
Probe (MS550s) FUJIFILM VisualSonics transmission frequency of 40 MHz
Scalpel VWR (SWANN-MORTON) 233-5363
Scissors, small Fine Science Tools (FST) 14558-09
Syringe, 5 mL VWR (TERUMO) 613-0973
Table spoon
Tape (Scotch Magic tape) Scotch
Tissue paper Tork
Tweezers large  VWR (USBECK Laborgeräte) 232-0107 See figure 1E
Tweezers small DUMONT Medical, Switzerland 0103-5/45 See figure 1F
Ultrasound contrast agent (custum made F-type) Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017).
Ultrasound contrast agent (MicroMarker) FUJIFILM VisualSonics, Inc.
Ultrasound contrast agent (Definity) Lantheus medical imaging, United States
Ultrasound gel Aquasonic
Waxi film (Parafilm) Parafilm
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm) VWR 611-0094
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (99), e1 (2015).
  2. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e1 (2016).
  3. Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e1 (2015).
  4. Oosterbaan, A. M., Ursem, N. T. C., Struijk, P. C., Bosch, J. G., van der Steen, A. F. W., Steegers, E. A. P. Doppler flow velocity waveforms in the embryonic chicken heart at developmental stages corresponding to 5-8 weeks of human gestation. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 33 (6), 638-644 (2009).
  5. McQuinn, T. C., Bratoeva, M., DeAlmeida, A., Remond, M., Thompson, R. P., Sedmera, D. High-Frequency Ultrasonographic Imaging of Avian Cardiovascular Development. Developmental Dynamics. 236 (12), 3503-3513 (2007).
  6. Stieger, S. M., Caskey, C. F., Adamson, R. H., Curry, F. E., Wisner, E. R., Ferrara, K. W. Enhancement of Vascular Permeability with Low-Frequency Contrast-enhanced Ultrasound in the Chorioallantoic Membrane Model. Radiology. 243 (1), 112-121 (2007).
  7. Skachkov, I., Luan, Y., van der Steen, A. F. W., De Jong, N., Kooiman, K. Targeted microbubble mediated sonoporation of endothelial cells in vivo. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (10), 1661-1667 (2014).
  8. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (11), 1162-1176 (2007).
  9. Rytelewski, M., Buensuceso, A., Leong, H. S., Deroo, B. J., Chambers, A. F., Koropatnick, J. Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In vivo. Journal of Visualized Experiments. (96), e1 (2015).
  10. Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., Silva, N. J. D. The Chick Chorioallantoic Membrane In vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of Visualized Experiments. (148), e1 (2019).
  11. Daeichin, V., Bosch, J. G., Needles, A., Foster, F. S., van der Steen, A., de Jong, N. Subharmonic, non-linear fundamental and ultraharmonic imaging of microbubble contrast at high frequencies. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (2), 486-497 (2015).
  12. Maresca, D., et al. Imaging microvasculature with contrast-enhanced ultraharmonic ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 40 (6), 1318-1328 (2014).
  13. Lindsey, B. D., et al. High Resolution Ultrasound Superharmonic Perfusion Imaging: In vivo Feasibility and Quantification of Dynamic Contrast-Enhanced Acoustic Angiography. Annals of Biomedical Engineering. 45 (4), 939-948 (2017).
  14. Paproski, R. J., Jovel, J., Wong, G. K. S., Lewis, J. D., Zemp, R. J. Enhanced detection of cancer biomarkers in blood-borne extracellular vesicles using nanodroplets and focused ultrasound. Krebsforschung. 77 (1), 3-13 (2017).
  15. Huang, C., et al. Short Acquisition Time Super-Resolution Ultrasound Microvessel Imaging via Microbubble Separation. Scientific Reports. 10, 1-13 (2020).
  16. Lowerison, M. R., Huang, C., Kim, Y., Lucien, F., Chen, S., Song, P. In vivo Confocal Imaging of Fluorescently Labeled Microbubbles: Implications for Ultrasound Localization Microscopy. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 67 (9), 1811-1819 (2020).
  17. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo Characterization of Ultrasound Contrast Agents: Microbubble Spectroscopy in a Chicken Embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e4 (2010).
  19. Kokhuis, T. J. A., et al. Intravital microscopy of localized stem cell delivery using microbubbles and acoustic radiation force. Biotechnology and Bioengineering. 112 (1), 220-227 (2015).
  20. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development. Journal of Visualized Experiments. (95), e6 (2015).
  21. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. Journal of Visualized Experiments. (33), e2 (2010).
  22. Hamburger, V., Hamilton, H. A Series Of Normal Stages In The Developent Of The Chick Embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 231-272 (1951).
  23. Ribatti, D. A morphometric study of the expansion of the chick vasculosa in shell-less culture. Journal of Anatomy. 186, 639-644 (1995).
  24. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Burri, P. H., Djonov, V. Chorioallantoic Membrane Capillary Bed: A Useful Target for Studying Angiogenesis and Anti-Angiogenesis In vivo. Anatomical Record. 324, 317-324 (2001).
  25. DeFouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the Microcirculation in the Chick Chorioallantoic Membrane during Normal Angiogenesis. Microvascular research. 38, 136-147 (1989).
  26. Beekers, I., van Rooij, T., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Verweij, M. D., Kooiman, K. Acoustic characterization of the CLINIcell for ultrasound contrast agent studies. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (1), 244-246 (2019).
  27. Lang, E. R., Rha, C. Apparent shear viscosity of native egg white. Journal of Food Science and Technology. 17, 595-606 (1982).
  28. Daeichin, V., et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging: In Vitro and In vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555-567 (2017).
  29. Mcferrin, H. E., Olson, S. D., Gutschow, M. V., Semon, J. A., Sullivan, D. E., Prockop, D. J. Rapidly Self-Renewing Human Multipotent Marrow Stromal Cells (hMSC) Express Sialyl Lewis X and Actively Adhere to Arterial Endothelium in a Chick Embryo Model System. PLoS ONE. 9 (8), 1-11 (2014).
  30. Akiyama, R., Mitsubayashi, H., Tazawa, H., Burggren, W. W. Heart rate responses to altered ambient oxygen in early (days 3-9) chick embryos in the intact egg. Journal of Comparative Physiology – B Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 169 (2), 85-92 (1999).
  31. Foster, F. S., Hossack, J., Adamson, S. L. Micro-ultrasound for preclinical imaging. Interface Focus. 1, 576-601 (2011).
  32. Gabrielli, M. G., Accili, D. The Chick Chorioallantoic Membrane: A Model of Molecular, Structural, and Functional Adaptation to Transepithelial Ion Transport and Barrier Function during Embryonic Development. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-12 (2010).
  33. van der Wagt, I., de Jong, I. C., Mitchell, M. A., Molenaar, R., van den Brand, H. A review on yolk sac utilization in poultry. Poultry Science. 99, 2162-2175 (2020).
  34. Kind, C. The development of the circulating blood volume of the chick embryo. Anatomy and Embryology. 147, 127-132 (1975).
  35. Ribatti, D. Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as a Useful Tool to Study Angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
  36. Schneider, M. Characteristics of SonoVue(TM). Echocardiography. 16 (7), 743-746 (1999).
  37. Kitzman, D. W., Goldman, M. E., Gillam, L. D., Cohen, J. L., Aurigemma, G. P., Gottdiener, J. S. Efficacy and Safety of the Novel Ultrasound Contrast Agent Perflutren (Definity) in Patients With Suboptimal Baseline Left Ventricular Echocardiographic Images. American Journal of Cardiology. 86, 669-674 (2000).
  38. Kosareva, A., Abou-Elkacem, L., Chowdhury, S., Lindner, J. R., Kaufmann, B. A. Seeing the Invisible-Ultrasound Molecular Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (3), 479-497 (2020).
  39. Al-Roubaie, S., Jahnsen, E. D., Mohammed, M., Henderson-Toth, C., Jones, E. A. V. Rheology of embryonic avian blood. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2473-2481 (2011).
  40. Helfield, B., Chen, X., Qin, B., Villanueva, F. S. Individual lipid encapsulated microbubble radial oscillations: Effects of fluid viscosity. The Journal of the Acoustical Society of America. 139 (1), 204-214 (2016).
  41. Metcalfe, J., Stock, M. K. Oxygen exchange in the chorioallantoic membrane, avian homologue of the mammalian placenta. Placenta. 14, 605-613 (1993).
  42. Tazawa, H. Oxygen and CO2 exchange and acid-base regulation in the avian embryo. American Journal of Zoology. 20, 395-404 (1980).
  43. Kooiman, K., et al. Ultrasound-Responsive Cavitation Nuclei for Therapy and Drug Delivery. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  44. Li, M., Pathak, R. R., Lopez-rivera, E., Friedman, S. L., Aguirre-ghiso, J. A., Sikora, A. G. The In ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e1 (2015).
  45. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e1 (2013).

Tags

Chicken EmbryoEx OvoChorioallantoic MembraneContrast-enhanced UltrasoundMicrobubble-mediated Drug DeliveryIn Vivo ModelEgg IncubationEggshell OpeningAlbumin RemovalEmbryo VisualizationYolk Exposure

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Meijlink, B., Skachkov, I., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Kooiman, K. The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies. J. Vis. Exp. (168), e62076, doi:10.3791/62076 (2021).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image