Metabolómica cuantitativa de Saccharomyces cerevisiae mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem
Summary
Presentamos un protocolo para la identificación y cuantificación de las principales clases de metabolitos solubles en agua en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El método descrito es versátil, robusto y sensible. Permite la separación de isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua entre sí.
Abstract
La metabolómica es una metodología utilizada para la identificación y cuantificación de muchos productos intermedios de bajo peso molecular y productos del metabolismo dentro de una célula, tejido, órgano, fluido biológico u organismo. La metabolómica se centra tradicionalmente en los metabolitos solubles en agua. El metaboloma soluble en agua es el producto final de una compleja red celular que integra varios factores genómicos, epigenómicos, transcriptómicos, proteómicos y ambientales. Por lo tanto, el análisis metabolómico evalúa directamente el resultado de la acción para todos estos factores en una gran cantidad de procesos biológicos dentro de varios organismos. Uno de estos organismos es la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae,un eucariota unicelular con el genoma completamente secuenciado. Debido a que S. cerevisiae es susceptible de análisis moleculares exhaustivos, se utiliza como modelo para diseccionar los mecanismos subyacentes a muchos procesos biológicos dentro de la célula eucariota. Un método analítico versátil para la evaluación cuantitativa robusta, sensible y precisa del metaboloma soluble en agua proporcionaría la metodología esencial para diseccionar estos mecanismos. Aquí presentamos un protocolo para las condiciones optimizadas de enfriamiento de la actividad metabólica y la extracción de metabolitos solubles en agua de las células de S. cerevisiae. El protocolo también describe el uso de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para el análisis cuantitativo de los metabolitos solubles en agua extraídos. El método LC-MS/MS de metabolómica no dirigida descrito aquí es versátil y robusto. Permite la identificación y cuantificación de más de 370 metabolitos solubles en agua con diversas propiedades estructurales, físicas y químicas, incluidos diferentes isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de estos metabolitos. Estos metabolitos incluyen varias moléculas portadoras de energía, nucleótidos, aminoácidos, monosacáridos, intermediarios de la glucólisis e intermedios del ciclo tricarboxílico. El método LC-MS/MS de metabolómica no dirigida es sensible y permite la identificación y cuantificación de algunos metabolitos solubles en agua a concentraciones tan bajas como 0,05 pmol/μL. El método se ha utilizado con éxito para evaluar metabolomas solubles en agua de células de levadura mutantes y de tipo silvestre cultivadas en diferentes condiciones.
Introduction
Los metabolitos solubles en agua son intermedios de bajo peso molecular y productos del metabolismo que contribuyen a los procesos celulares esenciales. Estos procesos conservados evolutivamente incluyen la conversión de nutrientes en energía utilizable, síntesis de macromoléculas, crecimiento celular y señalización, control del ciclo celular, regulación de la expresión génica, respuesta al estrés, regulación post-tralacional del metabolismo, mantenimiento de la funcionalidad mitocondrial, tráfico celular vesicular, autofagia, envejecimiento celular y muerte celular regulada1,2,3.
Muchos de estos papeles esenciales de los metabolitos solubles en agua han sido descubiertos por estudios en la levadura en ciernes S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Este eucariota unicelular es un organismo modelo útil para diseccionar mecanismos a través de los cuales los metabolitos solubles en agua contribuyen a los procesos celulares debido a su capacidad para realizar análisis bioquímicos, genéticos y biológicos moleculares avanzados23,24,25,26. Aunque los métodos LC-MS/MS de metabolómica no dirigida se han utilizado para estudiar las funciones de los metabolitos solubles en agua en la levadura en ciernes3,18,22,27,este tipo de análisis requiere la mejora de su versatilidad, robustez, sensibilidad y capacidad para distinguir entre diferentes isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de estos metabolitos.
Los últimos años están marcados por avances significativos en la aplicación de los métodos LC-MS/MS de metabolómica no dirigida al perfil de metabolitos solubles en agua in vivo. Sin embargo, muchos desafíos en el uso de esta metodología siguensiendo 2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Estos desafíos incluyen los siguientes. En primer lugar, las concentraciones intracelulares de muchos metabolitos solubles en agua están por debajo de un umbral de sensibilidad para los métodos utilizados actualmente. En segundo lugar, la eficiencia del enfriamiento de la actividad metabólica es demasiado baja, y el grado de fuga celular asociada al enfriamiento de metabolitos intracelulares es demasiado alto para los métodos actuales; por lo tanto, los métodos utilizados actualmente subestiman las concentraciones intracelulares de metabolitos solubles en agua. En tercer lugar, los métodos existentes no pueden diferenciar los isómeros estructurales (es decir, moléculas con la misma fórmula química pero diferente conectividad atómica) o estereoisómeros (es decir, moléculas con la misma fórmula química y conectividad atómica, pero con la diferente disposición atómica en el espacio) de metabolitos específicos; esto impide la correcta anotación de ciertos metabolitos por los métodos utilizados actualmente. Cuarto, las bases de datos en línea espectrales de masas existentes de iones padres (MS1) e iones secundarios (MS2) están incompletas; esto afecta a la correcta identificación y cuantificación de metabolitos específicos utilizando los datos brutos de LC-MS/MS producidos con la ayuda de los métodos actuales. En quinto lugar, los métodos existentes no pueden utilizar un solo tipo de extracción de metabolitos para recuperar todas o la mayoría de las clases de metabolitos solubles en agua. En sexto lugar, los métodos existentes no pueden utilizar un solo tipo de columna LC para separar entre sí todas o la mayoría de las clases de metabolitos solubles en agua.
Aquí, optimizamos las condiciones para apagar la actividad metabólica dentro de las células de S. cerevisiae, manteniendo la mayoría de los metabolitos solubles en agua dentro de estas células antes de la extracción y extrayendo la mayoría de las clases de metabolitos solubles en agua de las células de levadura. Desarrollamos un método versátil, robusto y sensible para la identificación y cuantificación basada en LC-MS/MS de más de 370 metabolitos solubles en agua extraídos de células de S. cerevisiae. Este método de metabolómica no dirigida permite evaluar las concentraciones intracelulares de varias moléculas portadoras de energía, nucleótidos, aminoácidos, monosacáridos, intermediarios de la glucólisis e intermedios del ciclo tricarboxílico. El método LC-MS/MS desarrollado permite la identificación y cuantificación de diferentes isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua con diversas propiedades estructurales, físicas y químicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para utilizar con éxito el protocolo descrito aquí, siga las medidas preventivas que se describen a continuación. El cloroformo y el metanol extraen diversas sustancias de los artículos de plástico de laboratorio. Por lo tanto, manejarlos con precaución. Evite el uso de plásticos en pasos que impliquen contacto con cualquiera de estos dos disolventes orgánicos. Use pipetas de vidrio de borosilicato para estos pasos. Levante estas pipetas con cloroformo y metanol antes de su uso. Use solo puntas de micropipeta y t…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Titorenko por las discusiones. Reconocemos al Centro de Aplicaciones Biológicas de espectrometría de masas, al Centro de Genómica Estructural y Funcional y al Centro de Microscopía e Imágenes Celulares (todos en la Universidad de Concordia) por sus excelentes servicios. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) de Canadá (RGPIN 2014-04482 y CRDPJ 515900 – 17). K.M. fue apoyado por la Beca Armand C. Archambault de la Universidad de Concordia y el Premio a la Excelencia del Decano de Artes y Ciencias de la Universidad de Concordia.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 | |
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