Drosophila'da Hızlı Bir Yemek Tercihi Tahlil
Summary
Sinekler için iki seçenekli bir besleme tahlilleri için bir protokol sunuyoruz. Bu besleme testini çalıştırmak hızlı ve kolaydır ve sadece küçük ölçekli laboratuvar araştırmaları için değil, aynı zamanda sineklerdeki yüksek verimli davranışsal ekranlar için de uygundur.
Abstract
Zararlı ajanların tüketiminden kaçınırken besin değeri olan yiyecekleri seçmek için, hayvanların yiyecek ortamlarını değerlendirmek için sofistike ve sağlam bir tat sistemine ihtiyaçları vardır. Meyve sineği, Drosophila melanogaster, gıda tercihinin moleküler, hücresel ve sinirsel temellerini çözmek için yaygın olarak kullanılan genetik olarak çekişli bir model organizmadır. Sinek yemi tercihlerini analiz etmek için sağlam bir beslenme yöntemine ihtiyaç vardır. Burada açıklanan, titiz, maliyet tasarrufu sağlayan ve hızlı olan iki seçenekli bir besleme tahlildir. Test Petri-dish bazlıdır ve yemeğin iki yarısına mavi veya kırmızı boya ile desteklenmiş iki farklı yiyeceğin eklenmesini içerir. Daha sonra, ~70 önceden tasarlanmış, 2-4 günlük sinekler yemeğe yerleştirilir ve yaklaşık 90 dakika boyunca karanlıkta mavi ve kırmızı yiyecekler arasında seçim yapmasına izin verilir. Her bir sineğin karnının incelenmesi, tercih indeksinin hesaplanması ile takip edilir. Çok katlı plakaların aksine, her Petri kabının doldurulması sadece ~ 20 s sürer ve zaman ve çaba tasarrufu sağlar. Bu besleme tahlili, sineklerin belirli bir yiyeceği sevip sevmediğini hızlı bir şekilde belirlemek için kullanılabilir.
Introduction
Sinekler ve memeliler arasındaki tat organlarının anatomik yapısındaki dramatik farklılıklara rağmen, sineklerin birçok lezzetli maddeye davranışsal tepkileri memelilerinkine çarpıcı bir şekilde benzer. Örneğin, sinekler şeker1,2,3,4,5,6,7,8, amino asitler9,10ve besinleri gösteren düşük tuz11‘i tercih eder, ancak acı yiyecekleri reddeder12,13,14,15 unpalatable veya toksiktir. Son yirmi yılda, sinekler, lezzetli algılama, tat transdüksiyon, tat plastisitesi ve besleme yönetmeliği 16 ,17,18 , 19,20dahil olmak üzere tat hissi ve gıda tüketimi ile ilgili birçok temel sorunun anlaşılmasını ilerletmek için son derece değerli bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır. Dikkat çekici bir şekilde, bir dizi çalışma, tat algısının altında kalan tat transdüksiyonunun ve sinir devresi mekanizmalarının meyve sinekleri ve memeliler arasında benzer olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, meyve sineği, araştırmacıların hayvanlar aleminde gıda tespiti ve tüketimini yöneten evrimsel olarak korunmuş kavramları ve ilkeleri ortaya çıkarmalarını sağlayan ideal bir deneysel organizma olarak hizmet eder.
Sineklerde tat alma hissini araştırmak için, gıda tercihini objektif olarak ölçmek için hızlı ve titiz bir test oluşturmak önemlidir. Yıllar içinde, çeşitli beslenme yöntemleri, boya bazlı tahliller11,12,13,21,22,23, sinek hortumu uzatma yanıtı24, Kılcal Besleyici (CAFE) tahlil25,26, Sinek Sıvı-Gıda Etkileşim Sayacı (FLIC) tahlil27, ve diğer kombinatoryal yöntemler, meyve sinekleri için gıda tercihini ve / veya gıda alımını nicel olarak ölçmek için geliştirilmiştir28,29,30,31. Popüler beslenme paradigmalarından biri, çok katlı bir mikrotiter plakası12 , 21,32 veya burada açıklandığı gibi, besleme odası olarak küçük bir Petri kabı11,22 kullanan boya bazlı iki seçenekli besleme tahlilleridir. Bu test, sineğin karnının şeffaflığına göre tasarlanmıştır. Bu test sırasında, sinekler besleme odasına yerleştirilir ve kırmızı boya veya mavi boya ile karıştırılmış iki yiyecek seçeneği ile sunulur. Test tamamlandıktan sonra, sinek karınları hangi yiyeceği tükettiğine bağlı olarak kırmızı veya mavi görünür.
Hem Petri kabı hem de çok plakalı boya bazlı besleme testleri oldukça sağlamdır ve yaklaşık olarak aynı sonuçları verir. Bu iki tahlil kullanılarak, gıda zevklerini ve gıda dokusunu algılamaktan sorumlu son derece çeşitlendirilmiş reseptörleri ve hücreleri deşifre etmek için çok sayıda önemli keşif ve atılım yapılmıştır11,12,21,22,32,33. Boya bazlı testte, önemli ölçüde zaman ve çaba gerektiren deneysel bir adım, yiyeceklerin hazırlanması ve beslenme odasına yüklenmesidir. Yiyecek hazırlama ve yükleme süresini azaltmak için, bu test, çok katlı mikroter plakanın iki eşit bölmeye ayrılmış küçük bir Petri kabı ile değiştirilmesiyle değiştirildi. Petri-dish bazlı testte, yemeğin iki yarısına mavi veya kırmızı boya ile desteklenmiş iki farklı yiyecek eklenir. Daha sonra, ~70 önceden tasarlanmış, 2-4 günlük sinekler yemeğe yerleştirilir ve yaklaşık 90 dakika boyunca karanlıkta mavi ve kırmızı yiyecekler arasında seçim yapmasına izin verilir. Daha sonra her sineğin karnı incelenir ve tercih indeksi (PI) hesaplanır.
Bu Petri-dish tabanlı iki seçenekli besleme tahlili uygun fiyatlı, basit ve hızlıdır. Bir multiwell tabağının doldurulması yaklaşık 110 s gerekirken, her Petri kabı sadece ~ 20 s sürer. Ek olarak, multiwell plakası, çok sayıda küçük kuyuya (örneğin, tabak başına 60 veya daha fazla kuyu) küçük hacimlerde yiyecek pipetleme gerektirir, bu da önemli ölçüde hassasiyet ve dikkat gerektirir. Tersine, Petri-dish tabanlı test plaka başına sadece iki eylem gerektirir. Besleme tahlili çok sayıda çoğaltma içerebileceğinden, Petri-dish tabanlı test önemsiz miktarda zaman ve çaba tasarrufu sağlar. Bu tahlil, çok katlı testten elde edilenlere eşdeğer sonuçlar verir ve tuz tadıkodlaması 11, gıda deneyimi22ile değiştirilen tat plastisitesi ve gıda dokusu duyusunun moleküler temeli33dahil olmak üzere tat duyusunda birçok temel soruyu ele almada başarılı olduğunu kanıtlamıştır. Özetle, bu Petri-dish tabanlı iki seçenekli test, sineklerin uygun beslenme davranışını ortaya çıkarmak için dış ve iç besin milieusunu nasıl algılayıp algılamayacaklarını araştırmak için güçlü bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, sorunların ortaya çıkabileceği birkaç önemli adımı içerir. İlk olarak, sineklerin istikrarlı veri sağlamak için yeterli miktarda yiyecek yuttmasını sağlayın. Sinekler zayıf beslenirse, sineklerin en az 24 saat boyunca ıslak aç olduğundan ve deneysel ortamın en az minimum sakkaroz konsantrasyonu (2 mM) içerdiğiden emin olun. Gıda tüketimini daha da teşvik etmek için, sineklerin fizyolojik durumuna bağlı olarak ıslak açlık süresini 24 saatin ötesine uzatın. Çok fazla sinek u…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, dr. Tingwei Mi’ye iki seçenekli beslenme testini optimize etmelerine yardımcı olduğu için teşekkür eder. Ayrıca Samuel Chan ve Wyatt Koolmees’e el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür etmek istiyorlar. Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri R03 DC014787 (Y.V.Z.) ve R01 DC018592 (Y.V.Z.) ve Ambrose Monell Vakfı tarafından finanse edildi.
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
Referenzen
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
- Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetik. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetik. 208 (4), 1291-1309 (2018).
