Summary

باستخدام Immunofluorescence للكشف عن PM2.5-الناجم عن تلف الحمض النووي في قلوب الأجنة حمار وحشي

Published: February 15, 2021
doi:

Summary

يستخدم هذا البروتوكول فحص المناعة للكشف عن تلف الحمض النووي الناجم عن PM2.5في القلوب التشريحية لأجنة حمار وحشي.

Abstract

يمكن أن يؤدي التعرض للجسيمات الدقيقة المحيطة (PM2.5)إلى سمية نمو القلب ولكن الآليات الجزيئية الأساسية لا تزال غير واضحة. 8-هيدروكسي-2’deoxygenase (8-OHdG) هو علامة على تلف الحمض النووي التأكسدي وγH2AX هو علامة حساسة لاستراقات حبلا مزدوجة الحمض النووي. في هذه الدراسة، كنا نهدف إلى الكشف عن PM2.5-الناجمة عن 8-OHdG و γH2AX التغييرات في قلب أجنة حمار وحشي باستخدام فحص immunofluorescence. عولجت أجنة حمار وحشي مع المسائل العضوية القابلة للاستخراج (EOM) من PM2.5 في 5 ميكروغرام / مل في وجود أو عدم وجود مضادات الأكسدة N-أسيتيل-L-السيستين (NAC, 0.25 ميكرومتر) في 2 ساعة بعد الإخصاب (hpf). تم استخدام DMSO كتحكم في السيارة. في 72 حصان، تم تشريح القلوب من الأجنة باستخدام إبرة حقنة وثابتة و permeabilized. بعد حظرها، تم فحص العينات مع الأجسام المضادة الأولية ضد 8-OHdG و γH2AX. ثم تم غسل العينات واحتضانها بأجسام مضادة ثانوية. وقد لوحظت الصور الناتجة تحت المجهر الفلوري وتم قياسها كميا باستخدام ImageJ. تظهر النتائج أن EOM من PM2.5 عززت بشكل كبير إشارات 8-OHdG و γH2AX في قلب أجنة حمار وحشي. ومع ذلك ، فإن NAC ، الذي يعمل كزبال لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، تصدى جزئيا لتلف الحمض النووي الناجم عن EOM. هنا، نقدم بروتوكولا للمناعة للتحقيق في دور تلف الحمض النووي في عيوب القلب الناجمة عن PM2.5التي يمكن تطبيقها للكشف عن التغيرات البيئية الناجمة عن التعبير البروتيني الناجم عن المواد الكيميائية في قلوب أجنة حمار وحشي.

Introduction

تلوث الهواء هو الآن مشكلة بيئية خطيرة تواجه العالم. الجسيمات الدقيقة المحيطة (PM2.5)،والتي تعد واحدة من أهم مؤشرات جودة الهواء، يمكن أن تحمل عددا كبيرا من المواد الضارة وتدخل في نظام الدورة الدموية في الدم، مما يسبب ضررا خطيرا لصحة الإنسان1. وقد أظهرت الدراسات الوبائية أن التعرض PM2.5 يمكن أن يؤدي إلى زيادة خطر عيوب القلب الخلقية (CHDs)2,3. كما أظهرت الأدلة المستقاة من التجارب على الحيوانات أن PM2.5 يمكن أن يسبب نموا غير طبيعي في القلب في أجنة حمار وحشي وذرية الفئران ولكن الآليات الجزيئية لسمية نمو القلب من PM2.5 لا تزال غير معروفة إلى حد كبير4،5،6.

تلف الحمض النووي يمكن أن يسبب توقيف دورة الخلية والحث على موت الخلايا المبرمج، والتي قد تدمر على نطاق واسع إمكانات خلايا السلف، وبالتالي، يضعف نمو القلب7). وقد تم توثيق جيدا أن الملوثات البيئية، بما في ذلك PM2.5،لديها القدرة على مهاجمة الحمض النووي من خلال آليات الإجهاد التأكسدي8،9. كل من الإنسان والحمار الوحشي تطور القلب حساسة للإجهاد التأكسدي10،11،12. 8-OHdG هو علامة تلف الحمض النووي التأكسدي، وإشارة γH2AX هو علامة على فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي. N-أسيتيل-L-السيستين (NAC), السلائف الاصطناعية من السيستين داخل الخلايا والجلوتاثيون, يستخدم على نطاق واسع كمركب مضاد للأكسدة. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم NAC للتحقيق في دور الإجهاد التأكسدي في PM2.5– تلف الحمض النووي المستحث13.

وقد استخدمت على نطاق واسع حمار وحشي كنموذج الفقاريات لدراسة تطور القلب وأمراض القلب والأوعية الدموية البشرية لأن آليات نمو القلب يتم الحفاظ عليها للغاية بين الفقاريات14،15. وتشمل مزايا استخدام حمار وحشي كنموذج صغر حجمها، والقدرة الإنجابية القوية، وانخفاض تكلفة التغذية. ذات أهمية خاصة لهذه الدراسات، أجنة حمار وحشي لا تعتمد على نظام الدورة الدموية خلال التنمية المبكرة ويمكن البقاء على قيد الحياة تشوه القلب الحاد14. وعلاوة على ذلك، فإن شفافيتها تسمح بمراقبة الجسم بأكمله مباشرة تحت المجهر. وهكذا، توفر أجنة حمار وحشي فرصة متميزة لتقييم الآليات الجزيئية المشاركة في تحريض سمية نمو القلب نتيجة التعرض لمختلف المواد الكيميائية البيئية5و16و17. لقد سبق أن ذكرت أن PM2.5-الناجم عن الإجهاد التأكسدي يؤدي إلى تلف الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج, مما أدى إلى تشوهات في القلب في حمار وحشي18. في هذه الدراسة، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للتحقيق PM2.5-الناجم عن تلف الحمض النووي في قلب أجنة حمار وحشي.

Protocol

تم الحصول على سمك الحمار الوحشي البري (AB) المستخدم في هذه الدراسة من المركز الوطني لموارد سمك الحمار الوحشي في ووهان، الصين. وقد تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية المبينة هنا والموافقة عليها من قبل مؤسسة رعاية الحيوان التابعة للجنة الأخلاقيات في جامعة سوتشو. 1. PM2.5 أخ?…

Representative Results

هذا الفحص immunofluorescence هو وسيلة حساسة ومحددة لقياس التغيرات التعبير البروتين في قلوب أجنة حمار وحشي تتعرض للمواد الكيميائية البيئية. في هذا التحليل التمثيلي، تم تقييم الأجنة المعرضة لPM2.5 في غياب أو وجود NAC المضادة للأكسدة لوجود تشوها?…

Discussion

على الرغم من أن سمك الحمار الوحشي هو نموذج فقاري ممتاز لدراسة سمية النمو القلبي للمواد الكيميائية البيئية ، بسبب صغر حجم قلب الجنين ، فمن الصعب الحصول على ما يكفي من البروتين لتحليل البقع الغربية. لذلك، نقدم طريقة immunofluorescence حساسة لتحديد مستويات التعبير البروتين من المؤشرات الحيوية تلف ال…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (رقم المنحة: 81870239، 81741005، 81972999) وتطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو.

Materials

8-OHdG Antibody Santa Cruz Biotechnology, USA sc-66036 Primary antibody
Analytical balance Sartorius,China BSA124S
BSA Solarbio,Beijing,China SW3015 For blocking
DAPI Abcam, USA ab104139 For nuclear counterstain.
DMSO Solarbio,Beijing,China D8371
Fluorescence microscope Olympus, Japan IX73 For imaging fluorescence signals/
Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 Carlsbad,USA CW0159 Secondary antibody
Goat Anti-Rabbit IgG FITC Carlsbad,USA RS0003 Secondary antibody
N-Acetyl-L-cysteine(NAC) Adamas-Beta, Shanghai, China 616-91-1
Orbital shaker QILINBEIER,China TS-1
Paraformaldehyde Sigma,China P6148 Make 4% paraformaldehyde for fixation.
Phosphate Buffered Saline HyClone,USA SH30256.01 Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.
PM2.5 sampler TianHong,Wuhan, China TH-150C For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.
Re-circulating aquaculture system HaiSheng,Shanghai,China The zebrafish was maintained in it.
Soxhlet extractor ZhengQiao,Shanghai, China BSXT-02 For organic components extraction.
Stereomicroscope Nikon,Canada SMZ645 For heart dissection from zebrafish embryos.
Tricaine methanesulfonate (MS222) Sigma,China E10521 To anesthetize zebrafish embryos
Tween 20 Sigma,China P1379
γH2AX Antibody Abcam, USA ab26350 Primary antibody

Referenzen

  1. Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
  2. Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
  3. Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
  4. Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
  5. Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
  6. Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
  7. Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d’Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
  8. Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
  9. Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
  10. Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
  11. Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
  12. Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
  13. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
  14. Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
  15. Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
  16. Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
  17. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
  18. van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
  19. Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
  20. Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
  21. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  22. Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Huang, Y., Tao, Y., Cai, C., Chen, J., Ji, C., Aniagu, S., Jiang, Y., Chen, T. Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts. J. Vis. Exp. (168), e62021, doi:10.3791/62021 (2021).

View Video