Isolement de l’ARN fécal (micro)
Summary
Ce protocole isole l’ARN total de haute qualité à partir d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. Un kit commercial d’isolation de miARN est utilisé avec une adaptation significative pour isoler l’ARN pur avec une quantité et une qualité optimisées. Les isolats d’ARN sont bons pour la plupart des tests d’ARN en aval tels que le séquençage, les micro-réseaux et la RT-PCR.
Abstract
Il devient clair que l’ARN existe dans la lumière intestinale et les matières fécales chez les animaux et les humains. Le protocole décrit ci-dessous isole l’ARN total, y compris les microARN, provenant d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. L’objectif est d’isoler l’ARN total avec une pureté et une quantité élevées pour des analyses en aval telles que le séquençage de l’ARN, la RT-PCR et les micro-réseaux. Les avantages de ce protocole optimisé dans l’isolement des miARN sont la capacité d’isoler des produits d’ARN hautement purifiés avec des étapes de lavage supplémentaires décrites, une quantité accrue d’ARN obtenue avec une méthode améliorée de remise en suspension de l’échantillon et des pointes importantes de décontamination. Une limitation est l’incapacité de traiter et de purifier un échantillon plus grand de plus de 200 mg, car ces tailles d’échantillon causeraient une difficulté dans la formation claire de l’interphase. Par conséquent, la grande taille de l’échantillon peut contaminer la phase aqueuse à extraire comme décrit dans le protocole avec des matières organiques qui affectent la qualité de l’ARN isolé à la fin. Cependant, les isolats d’ARN provenant d’un échantillon allant jusqu’à 200 mg sont suffisants pour la plupart des analyses en aval.
Introduction
L’ARN extracellulaire est de plus en plus reconnu comme un facteur important qui médie de nombreux processus biologiques1. L’ARN extracellulaire dans les matières fécales a été signalé pour la première fois en 2008 en tant que marqueur du cancer du côlon et de la colite ulcéreuse active2, et il a récemment été révélé comme un composant normal de la lumière intestinale et des matières fécales et médie les communications hôte-microbe 3,4,5. Le but de ce protocole d’isolement d’ARN est d’extraire de l’ARN extracellulaire de haute qualité à partir d’échantillons fécaux prélevés sur des sujets animaux et humains. Le protocole a été adapté à partir d’un kit commercial d’isolation de miARN. L’ARN acquis est utilisé pour des analyses en aval telles que le séquençage de l’ARN, la RT-PCR et la micro-matrice. Le protocole comprend plusieurs conseils importants et utiles pour maximiser la quantité et la qualité de l’ARN présent dans les excréments des animaux et des humains. La raison de développer et d’optimiser cette méthode d’isolement de l’ARN (y compris les microARN) est de diminuer l’ARN microbien dans les fèces, de limiter les variables dans les études de recherche et d’analyser la composition de l’ARN dans l’intestin sans tenir compte des divers facteurs de confusion et sources de contamination. Il convient de noter que cet isolement d’ARN minimise la libération d’ARN par les cellules vivantes et les microbes vivants (ARN cellulaire). Il se concentre sur les ARN extracellulaires qui ont été libérés par les cellules intestinales ou ont été acquis par la prise alimentaire. Principalement, cette méthode ne convient pas aux études où le transcriptome microbien est étudié.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est important d’utiliser une technique sans RNase pour prévenir la contamination par la RNase pendant l’isolement7. Après la centrifugation et la formation d’une interphase compacte, il est essentiel d’éviter l’interphase, la phase inférieure et le contaminant particulaire flottant au-dessus de la phase aqueuse lors de la récupération de la phase aqueuse. De plus, deux étapes de lavage avec 500 μL et 250 μL Wash Solution 2/3 sont ajoutées pour éliminer les contaminants dans…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous avons reçu une assistance technique de l’installation de biopolymères de la Harvard Medical School pour le bioanalyseur. Ce travail a été soutenu par la subvention de recherche RG-1707-28516 (H.L.W. et S.L.) de la National Multiple Sclerosis Society.
Materials
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
Referenzen
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