La cristallographie des protéines neutroniques est une technique structurelle qui permet la localisation des atomes d’hydrogène, fournissant ainsi des détails mécanistes importants sur la fonction des protéines. Nous présentons ici le flux de travail pour le montage d’un cristal de protéine, la collecte de données de diffraction neutronique, le raffinement de la structure et l’analyse des cartes de densité de longueur de diffusion neutronique.
La cristallographie neutronique est une technique structurelle qui permet de déterminer la position des atomes d’hydrogène dans les macromolécules biologiques, fournissant des informations mécaniquement importantes sur les états de protonation et d’hydratation sans induire de dommages causés par le rayonnement. La diffraction des rayons X, en revanche, ne fournit que des informations limitées sur la position des atomes de lumière et le faisceau de rayons X induit rapidement des dommages par rayonnement des cofacteurs photosensibles et des centres métalliques. Voici le flux de travail utilisé pour les lignes de faisceau IMAGINE et MaNDi au Oak Ridge National Laboratory (ORNL) afin d’obtenir une structure de diffraction neutronique une fois qu’un cristal de protéine de taille appropriée (> 0,1 mm3) a été cultivé. Nous démontrons le montage de cristaux de protéines hydrogénées dans des capillaires de quartz pour la collecte de données de diffraction neutronique. Le processus d’échange de vapeur des cristaux montés avec un tampon contenant du D2O est également présenté pour assurer le remplacement des atomes d’hydrogène sur les sites échangeables par du deutérium. L’incorporation de deutérium réduit le fond résultant de la diffusion incohérente des atomes d’hydrogène et empêche l’annulation de la densité causée par leur longueur de diffusion cohérente négative. Les stratégies d’alignement des échantillons et de collecte de données à température ambiante sont illustrées à l’aide de la collecte de données quasi-Laue à IMAGINE au réacteur à isotopes à haut flux (HFIR). En outre, le montage des cristaux et la congélation rapide dans l’azote liquide pour la collecte de données cryogéniques afin de piéger les intermédiaires de réaction labile sont démontrés à l’instrument à temps de vol MaNDi à la source de neutrons de spallation (SNS). La préparation des fichiers de données de coordonnées et de diffraction du modèle et la visualisation des cartes de densité de longueur de diffusion des neutrons (SLD) seront également abordées. Le raffinement de la structure par rapport aux données neutroniques uniquement ou par rapport aux données conjointes rayons X/neutrons pour obtenir une structure entièrement atomique de la protéine d’intérêt sera finalement discuté. Le processus de détermination d’une structure neutronique sera démontré à l’aide de cristaux de la polysaccharide lytique monooxygénase Neurospora crassa LPMO9D, une métalloprotéine contenant du cuivre impliquée dans la dégradation des polysaccharides récalcitrants via le clivage oxydatif de la liaison glycosidique.
La cristallographie macromoléculaire neutronique est une technique qui fournit une fenêtre unique sur la structure et la chimie sous-jacente des protéines. Conceptuellement similaire à la diffraction des rayons X, la diffraction des neutrons fournit des détails atomistiques de la structure macromoléculaire, cependant, l’interaction des neutrons avec les noyaux permet la localisation des atomes légers, souvent difficiles à détecter avec la diffraction des rayons X1. Au cours de la diffraction des rayons X, les rayons X se dispersent à partir du nuage d’électrons, ce qui rend les atomes légers tels que l’hydrogène (H) mal visibles dans les cartes de densité d’électrons qui n’ont pas une résolution proche de celle de sous-Ångström2. En revanche, l’intensité de diffusion des neutrons dépend d’interactions complexes avec le noyau, les isotopes d’un même élément affichant des longueurs de diffusion différentes. Par conséquent, les atomes légers et leurs isotopes, tels que l’hydrogène (1H) et le deutérium (2H ou D), ont une visibilité comparable à celle des atomes de carbone, d’azote et d’oxygène de l’épine dorsale dans les cartes de densité de longueur de diffusion des neutrons (SLD). De plus, comme l’ampleur de la diffusion des neutrons est indépendante du nombre d’électrons, la diffusion à partir d’éléments légers n’est pas obscurcie par les éléments lourds lorsqu’ils sont à proximité les uns des autres, comme on l’observe dans la diffusion des rayons X. La visibilité accrue de H et de son isotope D lors de l’utilisation de la diffraction neutronique fournit des informations précieuses sur l’état de protonation des résidus, cofacteurs et ligands catalytiquement importants et facilite l’orientation des molécules d’eau, révélant des informations importantes sur les mécanismes catalytiques et la chimie des protéines3. La diffraction neutronique offre également l’avantage d’être une technique non destructive, particulièrement adaptée aux échantillons biologiques sensibles à l’ionisation tels que les protéines à centres métalliques ou les cofacteurs redox photosensibles2. L’objectif principal de cet article est de fournir une vue d’ensemble du flux de travail pour obtenir une structure cristalline de protéine neutronique de haute qualité. Nous renvoyons le lecteur intéressé à Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 et O’Dell et al.3 pour un excellent aperçu de la diffraction des protéines neutroniques et Ashkar et al.7 pour d’autres applications de la diffusion neutronique.
Les neutrons sont principalement générés au cours de réactions nucléaires utilisant l’un des deux processus suivants : la fission nucléaire aux sources du réacteur ou la spallation aux sources basées sur les accélérateurs8. Les sources de réacteur fournissent un faisceau de neutrons continu en utilisant la fission nucléaire de l’isotope 235U tandis que les sources de neutrons de spallation produisent un faisceau de neutrons pulsés en bombardant une cible, par exemple un métal liquide tel que le mercure, avec des protons9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) à Oak Ridge, Tennessee, héberge à la fois une source de neutrons à l’état d’équilibre au réacteur à isotopes à haut flux (HFIR) et une source pulsée de 60 Hz à la source de neutrons de spallation (SNS). La ligne de faisceau IMAGINE, située au niveau du HFIR, est un diffractomètre à neutrons optimisé pour les macromolécules biologiques (Figure supplémentaire 1)10. IMAGINE utilise un détecteur à plaque d’image neutronique pour mesurer les données quasi-Laue en utilisant une passe de bande étroite comprise entre 2,8 et 4,5 Å à partir de monocristaux avec des bords de cellule unitaires <150 Å. Le diffractomètre à neutrons macromoléculaires (MaNDi), situé au SNS, est un diffractomètre à neutrons Laue à temps de vol (TOF) équipé d’un cadre sphérique à réseau de détecteurs (DAF) (Figure supplémentaire 2)11. MaNDi mesure les données des monocristaux avec des bords de cellules unitaires compris entre 10 et 300 Å en utilisant une bande passante accordable de 2 Å-longueur d’onde comprise entre 2,0 et 6,0 Å12.
Le processus de génération de neutrons est très énergivore, ce qui entraîne des flux de faisceaux de neutrons relativement faibles par rapport aux flux de faisceaux de rayons X aux sources synchrotron13. Pour garantir des rapports signal/bruit suffisants lors de la collecte des données, il est nécessaire de faire pousser des cristaux de taille et de qualité appropriées14. En règle générale, des cristaux d’un volume > 0,1 mm3 sont nécessaires pour collecter des données avec des statistiques adéquates15. Outre les flux plus faibles, les propriétés inhérentes à l’interaction entre les neutrons et les noyaux de l’échantillon doivent être prises en considération16. La longueur de diffusion des neutrons diffère pour les isotopes d’un même élément, une propriété qui peut être avantageusement exploitée dans la diffusion neutronique à petit angle (SANS) pour masquer ou mettre en évidence les régions d’un échantillon – un processus connu sous le nom de correspondance de contraste17. Dans les expériences de diffraction, la longueur de diffusion de neutrons cohérents négatifs de H (-3,741 fm pour 1H) peut entraîner l’annulation des caractéristiques de la carte de densité de diffusion des neutrons puisque les longueurs de diffusion de neutrons cohérents d’autres atomes biologiquement pertinents, y compris le carbone (6,6511 fm pour 12C), l’azote (9,37 fm pour 14N), l’oxygène (5,803 fm pour 16O), le phosphore (5,13 fm pour le 31P) et le soufre (2,804 fm pour le 32S) sont positifs (tableau 1)12,14. En outre, la grande longueur de diffusion incohérente de H (25,274 fm) augmente l’arrière-plan lors de la collecte des données, ce qui entrave la qualité de l’ensemble de données et compromet la résolution des données7. Pour contourner ces limitations introduites par H, il est nécessaire, pour la diffraction des neutrons, d’échanger H contre son isotope deutérium, 2H (D), qui a une longueur de diffusion neutronique cohérente positive (6,671 fm) et une longueur de diffusion incohérente significativement inférieure (4,04 fm)19. Ceci peut être réalisé par perdeuteration, un processus dans lequel la protéine est exprimée par des organismes cultivés dans des milieux entièrement deutérés assurant l’incorporation complète de D sur les sites H20. Il est également possible de devenir partiellement des protéines en remplaçant H par D uniquement sur les sites échangeables (groupes titrables) tandis que les sites liés au carbone non échangeables restent hydrogénés21. Cela peut être réalisé par la croissance de cristaux de protéines hydrogénées dans la liqueur mère deutérée22. Le plus souvent, cependant, l’échange H / D de protéines hydrogénées est effectué par échange de vapeur après la croissance de cristaux de taille appropriée dans un tampon à base de H2O23. Dans de tels cas, les cristaux sont montés dans un capillaire de quartz et équilibrés à la vapeur avec une liqueur mère à base de D20.
Les flux de neutrons limités aux sources de neutrons se traduisent par des temps de collecte de données plus longs, allant de quelques jours à plusieurs semaines24. À l’ORNL, IMAGINE et MaNDi utilisent tous deux une bande passante de longueur d’onde étroite dans la gamme 2–6 Å pour optimiser la collecte de données25. Les données peuvent être collectées à température ambiante ou à température cryogénique. La collecte de données cryogéniques peut potentiellement améliorer la qualité des données et ouvrir la possibilité d’intermédiaires catalytiques par congélation. Après la collecte de données sur la diffraction des neutrons, un ensemble de données de rayons X est généralement collecté sur le même cristal à la même température ou sur un cristal cultivé dans des conditions identiques26. La collecte de données à la même température permet d’affiner la structure par rapport aux données de rayons X et de neutrons, empêchant ainsi tout artefact potentiel induit par la température, tel que les changements de visibilité et de position des eaux ou l’occupation de résidus avec des conformations alternatives27. Le raffinement conjoint des données neutroniques des rayons X augmente le rapport données-paramètres et offre l’avantage de permettre d’affiner les coordonnées de l’épine dorsale des protéines par rapport aux données des rayons X, tandis que les données de diffraction des neutrons sont utilisées pour affiner la position des atomes H/D28. Ceci est particulièrement utile lors de l’utilisation d’échantillons partiellement deutérés, où l’annulation de la densité due aux atomes H sur des sites non échangeables sur la protéine est présente. Bien que le nombre de structures de rayons X dépasse de loin le nombre de structures neutroniques déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB), les progiciels initialement conçus pour le raffinement des données de rayons X ont été étendus pour englober également les données neutroniques3,29,30. Après la collecte des données, les modèles peuvent être affinés à l’aide de packages de raffinement tels que phenix.refine, CNSsolve (nCNS) ou SHELXL28,31,32,33. Au cours du processus d’affinement, les cartes de densité de diffusion des neutrons peuvent être visualisées pour un ajustement manuel à l’aide de COOT34. Suivant la solution de structure, les coordonnées et les fichiers de données de diffraction des neutrons et/ou des rayons X peuvent être soumis à l’APB, qui validera et déposera le modèle, le rendant accessible au public18,29,30.
L’analyse structurale des protéines est une approche à multiples facettes dans laquelle de nombreuses techniques sont utilisées pour sonder leur fonction et leur mécanisme35. La cristallographie des protéines neutroniques fournit des informations chimiques précieuses pour développer et compléter les résultats d’études supplémentaires telles que la diffraction des rayons X, la spectroscopie, la résonance magnétique nucléaire (RMN) ou la diffraction électronique microcristalline (microED)36. La diffraction des protéines neutroniques est particulièrement bien placée pour fournir des informations sur les mécanismes enzymatiques, car les atomes H sont au cœur de leur chimie. L’absence de dommages radiologiques induits par les neutrons en fait une sonde exceptionnellement adaptée à l’étude des métalloprotéines37. Nous présentons ici un exemple représentatif du processus de diffraction des protéines neutroniques de la préparation des échantillons à la collecte, au raffinement et à l’analyse des données (Figure 1). Des cristaux de taille suffisante pour les expériences de diffraction neutronique ont été cultivés à partir de la métalloprotéine Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D est une métalloprotéine contenant du cuivre impliquée dans la dégradation de la cellulose récalcitrante par insertion d’atomes d’oxygène à la liaison glycosidique38,39. Le site actif du NcLPMO9D contient un centre de cuivre mononucléaire au sein d’un « corset d’histidine » caractéristique composé de l’histidine N-terminale et d’une deuxième histidine conservée (figure supplémentaire 3)40. Le N-terminal des LPMO fongiques est méthylé mais la modification post-transitionnelle ne se produit pas lors de l’expression recombinante dans la levure. Dans l’état de repos NcLPMO9D, le centre de cuivre est présent dans un état d’oxydation Cu2+ et est activé par réduction d’un seul électron en Cu1+, permettant à l’oxygène moléculaire de se lier et d’être activé en étant rapidement réduit à une espèce de superoxyde41,42. La réaction globale de NcLPMO9D nécessite l’ajout d’un électron et de deux protons pour former le produit polysaccharidique hydroxylé43. L’identité des espèces d’oxygène activée responsables de l’extraction d’atomes d’hydrogène (HAA) du substrat polysaccharidique n’a pas été identifiée et des études structurelles et informatiques intensives sont actuellement en cours44,45. Compte tenu de la chimie redox sur le site actif ncLPMO9D, l’atténuation des dommages causés par les rayonnements est particulièrement pertinente. Nous illustrons ici la collecte de données sur la température ambiante et la cryo-température sur les cristaux NcLPMO9D afin de déterminer la structure NcLPMO9D à l’état de repos et sous forme réduite activée, respectivement46. L’accent sera mis sur le montage de cristaux de protéines, la configuration d’instruments de ligne de faisceau pour la collecte de données, la préparation des fichiers de données et de coordonnées et les étapes de raffinement nécessaires pour modéliser une structure neutronique entièrement atomique.
La cristallographie des protéines neutroniques est une technique très sensible pour sonder les états de protonation et l’orientation des molécules d’eau dans les protéines. Cette information met en lumière les mécanismes catalytiques des protéines, car les changements dans les interactions de protonation et de liaison hydrogène sont souvent au cœur de la chimie enzymatique10. La cristallographie des protéines neutroniques, bien qu’il s’agisse d’une technique informative, comporte un certain nombre de facteurs à prendre en considération avant de planifier une expérience de diffraction neutronique, à savoir:
La cristallographie des protéines neutroniques est une technique à flux limité. Contrairement aux ensembles de données de diffraction des rayons X, des facteurs R plus élevés et des rapports d’exhaustivité, de redondance et de signal/bruit plus faibles sont attendus pour les ensembles de données de neutrons en raison des limites inhérentes à la technique (flux limité, quasi-Laue, longueurs d’onde plus longues). La collecte de données d’une seule image dure généralement de 12 à 18 heures. Le succès d’une expérience dépend fortement de la taille et de la qualité de l’échantillon, les cristaux de 0,1 mm3 étant souvent l’exigence minimale3. La diffraction neutronique nécessite la production de grandes quantités de protéines pour mettre en place des gouttes de cristallisation allant de 10 à 800 μL. Le volume minimum pour la croissance de cristaux suffisamment gros peut être estimé à l’aide d’un calculateur de volume compte tenu des paramètres du cristal et de l’échantillon (https://neutrons.ornl.gov/imagine). La croissance de gros cristaux a été le plus souvent réalisée par diffusion de vapeur3. La cristallisation des gouttes suspendues permet la croissance des cristaux en grosses gouttes allant de 10 à 25 μL, tandis que des gouttes plus grandes allant jusqu’à ~ 50 μL peuvent être mises en place à l’aide d’équipements de chute assis disponibles dans le commerce14,54. Les plaques de verre siliconées à neuf puits peuvent être utilisées pour mettre en place de très grandes gouttes, avec des volumes allant jusqu’à 800 μL. Ces plaques de verre sont placées dans des « boîtes à sandwich » disponibles dans le commerce auprès de Hampton Research. D’autres techniques de cristallisation comprennent la cristallisation par lots, dans laquelle la limite de la taille de la goutte est dictée par le récipient. La mise en place d’une expérience de cristallisation par lots peut aller du microlitre au millilitre55. La cristallisation peut également être réalisée à l’aide de la technique de dialyse dans laquelle la protéine est équilibrée avec le précipitant via une membrane de dialyse ou par contre-diffusion le long d’un gradient de concentration de précipitant ou à travers un bouchon poreux tel que l’agarose56,57. L’ensemencement offre une autre alternative pour obtenir des cristaux du volume souhaité. Les micro- et macro-ensemencements ont été utilisés avec succès pour la croissance de gros cristaux, y compris le grand cristal de NcLPMO9D45. Certaines connaissances du diagramme de phase protéique, y compris l’influence de la température sur la solubilité, aident à la croissance de gros cristaux.
Lors de la planification d’une expérience de diffraction neutronique, l’optimisation de la préparation des protéines pour maximiser le rapport signal/bruit lors de la collecte de données de diffraction est essentielle7. Pour contourner l’annulation de la densité et la diffusion incohérente élevée causée par les atomes H, les cartes SLD neutroniques peuvent être améliorées en échangeant des atomes H contre son isotope D, qui possède une longueur de diffusion cohérente positive et une faible longueur de diffusion incohérente. Pour ce faire, l’échange de vapeur du cristal de protéine hydrogéné contre le tampon de cristallisation deutéré est effectué. Cela assure l’échange H/D des molécules de solvant et des atomes de protéine H labiles et titrables23. L’échange de vapeur est effectué en montant le cristal hydrogéné dans un capillaire de quartz avec des « bouchons » tampons de cristallisation deutérés à base de D2O et il représente une technique efficace et douce qui est le plus souvent appliquée14,23,35. L’échange peut prendre plusieurs semaines et nécessite de préférence que le tampon deutéré soit fréquemment changé pour assurer un échange H/D maximal. L’échange H/D peut également être effectué en trempant directement le cristal dans un tampon deutéré. Pour éviter de placer le cristal sous contrainte en raison de l’exposition au D2O, le processus de trempage doit être effectué progressivement en augmentant progressivement le rapport D2O:H2O58. En plus de cela, la cristallisation des protéines hydrogénées peut également être réalisée dans un tampon deutéré pour l’échange H/D sur des sites H labiles22,59. Il convient toutefois de noter que le tampon à base de D2O a un effet sur la solubilité des protéines nécessitant un ajustement supplémentaire des conditions connues à base de H2O3,59. On a également observé que les tampons à base de D2O conduisaient à des cristaux plus petits dans certains cas59. L’échange complet d’atomes H titrables et liés au carbone en D peut être réalisé en exprimant des protéines dans des milieux deutérés pour générer un échantillon perdeuterated20. Les cartes SLD neutroniques résultantes de l’échantillon perruqué seront considérablement améliorées, n’affichant plus l’annulation de densité de la contrepartie de l’échantillon hydrogéné. Ceci est bénéfique lors de la caractérisation de la liaison H / D à des sites non échangeables dans une protéine ou un cofacteur. Cependant, l’expression de la protéine perdeuterated est à la fois élevée en coût et faible en rendement60. Le Centre de biologie moléculaire structurale (CSMB) du Laboratoire national d’Oak Ridge (ORNL) offre une installation de deutération aux utilisateurs qui cherchent à générer un échantillon perdeuterated (https://www.ornl.gov/facility/csmb). L’expression perdeutérisée est généralement réalisée dans un bioréacteur sur l’échelle 1 L produisant environ 50 mg de protéines purifiées61.
Après la collecte des données de diffraction des neutrons, le raffinement et la construction de modèles interactifs sont effectués. Le raffinement peut être exécuté à l’aide de plusieurs suites logicielles, notamment phenix.refine, nCNS ou SHELXL28,31,32,33. La suite Phenix est le logiciel le plus couramment utilisé pour affiner les données de diffraction des neutrons en conjonction avec Coot qui est utilisé pour construire manuellement le modèle à partir des cartes SLD neutroniques34. Bien que Phenix et Coot permettent tous deux le traitement des données de diffraction des neutrons, ils peuvent manquer de certaines caractéristiques nécessaires pour traiter les idiosyncrasies associées aux données neutroniques et aux échantillons deutérés. Par exemple, Coot ne contient pas d’optimisation géométrique pour les résidus deutérés, ce qui peut entraîner des complications lors de la construction du modèle puisque la fonction « Real Space Refine » entraîne une « explosion » des résidus (Figure supplémentaire 26)62. Cela peut être résolu en générant des fichiers de contention pour tous les résidus deutérés. Cependant, il s’agit d’un processus intensif et ces bibliothèques ne sont actuellement pas accessibles au public. Lors de l’exécution des améliorations dans Phenix, les sites H/D échangeables seront initialement fixés à 0,50 occupation pour H et D. Au fur et à mesure des améliorations, l’occupation de H et D sera affinée en fonction des cartes SLD neutroniques. Lors de la construction de modèles interactifs, les cartes Fo-Fc de densité de différence sont très informatives pour évaluer les occupations H / D. Les cartes peuvent être utilisées pour déterminer quels sites possèdent une occupation D élevée, ce qui est particulièrement instructif sur le site actif où les états de protonation sont catalytiquement pertinents63. Des situations ambiguës se présentent, cependant, lorsque le H:D l’occupation est proche de 0,70:0,30, ce qui entraîne l’annulation complète du signal dans les cartes SLD neutroniques64. Il faut également tenir compte du fait que les ensembles de données neutroniques quasi-Laue ont souvent une exhaustivité d’environ 80%, ce qui est inférieur aux ≥ 98% couramment observés pour les données de diffraction des rayons X. Lors de l’affinement des données de diffraction neutronique dans Phenix, les amplitudes observées manquantes (Fo) sont donc calculées à partir du modèle pour compléter la liste de réflexion, introduisant ainsi un biais de modèle. Pour tenir compte de ce biais potentiel, les cartes « no_fill » devraient être examinées lors de la construction de modèles interactifs plutôt que les cartes « remplies ».
Les utilisateurs peuvent choisir d’effectuer un raffinement conjoint des données de rayons X / neutrons de leur structure, ou un raffinement des données neutroniques uniquement. La visualisation de cartes SLD neutroniques, en particulier à basse résolution, peut être initialement déconcertante, en particulier pour une protéine hydrogénée dans laquelle H est toujours présent sur des sites non échangeables malgré l’échange de vapeur H / D. Il en résulte des annulations de cartes de densité neutronique, donnant l’impression de cartes discontinues65,66. La collecte d’un jeu de données radiographiques correspondant complète avantageusement ces annulations dans un raffinement conjoint (Figure 13A et Figure 13B). Une stratégie de raffinement conjoint consiste généralement à affiner les coordonnées de l’épine dorsale des protéines par rapport aux données de rayons X, tandis que les données de diffraction des neutrons sont utilisées pour affiner la position et l’occupation des atomes H/D sur des sites échangeables28. Étant donné que l’introduction de l’occupation conjointe H/D sur les sites échangeables augmente le nombre de paramètres affinés, un raffinement conjoint avec des données radiographiques augmente également le rapport données-paramètres. Un raffinement conjoint nécessite qu’un ensemble de données de rayons X correspondant soit collecté à la même température sur le même cristal ou un cristal cultivé dans les mêmes conditions. Pour les données de diffraction neutronique recueillies à température ambiante (300 K), l’ensemble de données en rayons X correspondant doit être recueilli à température ambiante à l’aide d’une stratégie de collecte de données à faible dose pour limiter les dommages causés par les rayonnements. Les échantillons perdeuterated, en revanche, fournissent des cartes SLD neutroniques améliorées et continues car ils ne possèdent pas la même magnitude d’annulation du signal H / D. Cependant, la longueur de diffusion neutronique de certains éléments, y compris les métaux et le soufre, les rend mal visibles dans les cartes SLD neutroniques, même si la protéine a été perruquée (Figure 13C-F)18. Si un métal doit être caractérisé, il est préférable d’utiliser la diffraction des rayons X dans un raffinement conjoint ou d’appliquer des techniques spectroscopiques pour compléter les expériences de diffraction. Les raffinements des données neutroniques uniquement sont souvent effectués lorsque l’ensemble de données neutroniques a une résolution élevée ou si une protéine perdeuterated a été utilisée. En outre, le raffinement des données sur les neutrons uniquement est particulièrement utile si une protéine très sensible aux dommages causés par les rayonnements est à l’étude, car une structure dérivée des rayons X peut posséder des artefacts induits par les rayonnements. Si un raffinement des données neutroniques uniquement doit être effectué, il faut vérifier si l’ensemble de données neutroniques correspondant est suffisamment complet et résolution.
ORNL offre deux installations pour la collecte de données de diffraction neutronique : la ligne de faisceau IMAGINE au HFIR ainsi que la ligne de faisceau MaNDi au SNS36,67. Bien que les deux instruments fournissent des moyens efficaces de collecter un ensemble de données de diffraction neutronique utilisant des principes similaires, chaque instrument a des spécifications uniques qui doivent être prises en compte lors de l’application du temps de faisceau. IMAGINE collecte des données quasi-Laue et est optimisé pour la collecte de données à température ambiante sur des cristaux avec des cellules unitaires jusqu’à ~100 Å. MaNDi peut être utilisé pour la collecte de données de température ambiante et de cryo-température en utilisant la collecte TOF-Laue sur des cristaux avec des cellules unitaires jusqu’à ~ 300 Å. Avant de collecter un ensemble de données complet, un test est effectué sur le cristal pour évaluer la qualité du motif de diffraction obtenu dans lequel le cristal est exposé au faisceau de neutrons pour une seule image. Si le cristal est de qualité suffisante, un ensemble de données complet sur la diffraction des neutrons sera collecté, indexé, intégré, mis à l’échelle et fusionné dans un processus analogue au traitement des données par rayons X. IMAGINE utilise Lauegen et Lscale et MaNDi utilise le package Mantid et utilise un raccord de profil tridimensionnel48,50,51,68,69,70. Les scientifiques qui deviennent des utilisateurs de l’une ou l’autre de ces installations recevront un ensemble de données au format MTZ ou HKL pour une analyse plus approfondie.
La diffraction neutronique est une technique non destructive et très sensible pour sonder l’état de protonation et les interactions de liaison hydrogène des macromolécules biologiques. Il est particulièrement utile pour les protéines photosensibles et les métalloprotéines. Plusieurs considérations concernant la technique ainsi que le traitement des données doivent être prises en compte avant de mener une expérience, mais le résultat donne des résultats qui peuvent donner un aperçu précieux du mécanisme catalytique de la protéine d’intérêt. La cristallographie des protéines neutroniques complète les études computationnelles, structurelles, biochimiques et spectroscopiques, ce qui en fait un outil précieux dans la boîte à outils des techniques utilisées par le biologiste pour caractériser les macromolécules biologiques.
The authors have nothing to disclose.
Des expériences d’expression, de purification et de cristallisation des protéines ont été menées au Center for Structural Molecular Biology (CSMB), un centre d’utilisateurs de recherche biologique et environnementale du département de l’Énergie des États-Unis au Oak Ridge National Laboratory. Les données de diffraction des neutrons ont été recueillies au BL-11B MaNDi à la source de neutrons de spallation (SNS) de l’ORNL, qui est parrainée par la Division des installations pour les utilisateurs scientifiques, Office of Basic Energy Sciences, Département de l’énergie des États-Unis. Les auteurs remercient Brendan Sullivan pour son aide à la réduction des données. Les données de diffraction des rayons X ont été collectées dans les installations du Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center (METRIC) de la North Carolina State University, qui est soutenue par l’État de Caroline du Nord. GCS reconnaît le soutien en partie de la National Research Foundation (NRF), de l’Afrique du Sud et du programme Graduate Opportunities (GO!) de l’ORNL. FM reconnaît le soutien de l’USDA NIFA Hatch 211001.
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length | DiaDent/DiaVet | 218-292 | |
Capillary wax | Hampton | HR4-328 | |
CCP4 | Version 7.0.077 | ||
Conical Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | CLS430790 | |
Conical Centrifuge Tubes (50mL) | Corning | CLS430828 | |
Coot | Version 0.8.9.2 | ||
CrystalCap ALS | Hampton | HR4-779 | |
Curved-Tip Forceps | Mitegen | TW-CTF-1 | |
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
Deuterium oxide 99.9 atom % D | Sigma-Aldrich | 151882 | |
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm | Mitegen | M5-L18SP-1000 | |
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit | Mettler Toledo | 30266626 | |
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml | Spearlab | M-FD-800 | |
Four Color Mounting Clay | Hampton | HR4-326 | |
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T), | Sigma-Aldrich | 54457 | |
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector | Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris | XtaLAB Synergy-R | Home source X-ray diffractometer |
Magnetic Wand Straight | Mitegen | M-R-1013198 | |
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.) | Eppendorf | 930001007 | |
Microtubes volume 1.5 mL | Eppendorf | Z606340 | |
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter | Fischerbrand | FB0875713 | |
Phenix | Version 1.14-3260 | ||
Pin Tong 18 mm | Mitegen | M-R-1013196 | |
Pipette Volume 0.1-2.5 μL | Eppendorf Research | Z683779 | |
Pipette Volume 100-1000 μL | Eppendorf Research | Z683825 | |
Pipette Volume 10-100 μL | Eppendorf Research | Z683809 | |
Pipette Volume 20-200 μL | Eppendorf Research | Z683817 | |
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length | Hampton | HR6-146 | Thin-walled capillary |
Research Stereomicroscope System | Olympus | SZX16 | |
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases | Mitegen | GB-B3-R | |
Round – Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length | VitroCom | CV1012 | Thick-walled capillary |
Sandwich Box with cover | Hampton | HR3-132 | |
Siliconized 9 Well Glass Plate | Hampton | HR3-134 | |
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well) | Mitegen | XQ-P-24S-A | |
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D | Sigma-Aldrich | 176788 | |
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm) | Hampton | HR3-247 | |
Universal Pipet Tips, 0.1 – 10 µL | VWR | 76322-528 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 100 µL | VWR | 76322-136 | |
Universal Pipet Tips, 100 – 1000 µL | VWR | 76322-154 | |
Universal Pipet Tips, 20 – 200 µL | VWR | 76322-150 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 20 µL | VWR | 76322-134 | |
Wax pen | Hampton | HR4-342 |