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Neuroscience

बरकरार रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम के साथ ऑर्गैयपिक माउस रेटिना एक्सप्लांट की लंबी अवधि, सीरम-मुक्त खेती

Published: November 25, 2020 doi: 10.3791/61868
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल माउस न्यूरोरेटिनाके ऑर्गेनोटिपिक एक्सप्लांट का वर्णन करता है, जो सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त आर16 परिभाषित माध्यम में अपने रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) के साथ मिलकर खेती करता है। वीवो प्रयोगों की तुलना में यह विधि प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल है, कम खर्चीला और समय लेने वाली है, और कई प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

नेत्र अनुसंधान में न्यूरोरेटिना के इन विट्रो मॉडल की सख्त जरूरत है। यहां, हम अक्षुण्ण रेटिना वर्णक एपिथेलियम (आरपीई) के साथ माउस न्यूरोरेटिना के ऑर्गेनोटिपिक खेती के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। अनुसंधान प्रश्न के आधार पर, रेटिना जंगली प्रकार के जानवरों से या रोग मॉडल से अलग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, अध्ययन करने के लिए, मधुमेह रेटिनोपैथी या वंशानुगत रेटिना अध: पतन । शुरुआती प्रसवोत्तर दिन से आंखें 2-9 जानवरों को एसेप्टिक परिस्थितियों में नाभिित किया जाता है। वे आंशिक रूप से प्रोटीन के में पचा रहे है आरपीई से choroid की एक टुकड़ी के लिए अनुमति देते हैं । स्टीरियोस्कोप के तहत, कॉर्निया में एक छोटा सा चीरा बनाया जाता है जिसमें दो किनारों का निर्माण किया जाता है जहां से कोरॉइड और स्क्लेरा को धीरे-धीरे आरपीई और न्यूरोरेटिना से छीला जा सकता है। इसके बाद लेंस को हटा दिया जाता है और आईकप को चार बिंदुओं में काटा जाता है ताकि इसे क्लोवर लीफ जैसा चार-अंकित आकार दिया जा सके । ऊतक अंततः एक सेल संस्कृति में एक फांसी ड्रॉप में स्थानांतरित कर दिया जाता है जिसमें पॉलीकार्बोनेट कल्चर झिल्ली होती है। संस्कृतियों तो R16 माध्यम में बनाए रखा जाता है, सीरम या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना, पूरी तरह से परिभाषित शर्तों के तहत, एक मध्यम परिवर्तन के साथ हर दूसरे दिन ।

वर्णित प्रक्रिया रेटिना के अलगाव और कम से कम 2 सप्ताह की खेती अवधि के लिए अपने सामान्य शारीरिक और हिस्टोटीपिक संदर्भ के संरक्षण में सक्षम बनाती है। ये विशेषताएं ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों को उच्च भविष्य कहनेवाला मूल्य के साथ एक उत्कृष्ट मॉडल बनाती हैं, रेटिना विकास, रोग तंत्र और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में अध्ययन के लिए, जबकि औषधीय स्क्रीनिंग को भी सक्षम बनाती हैं।

Introduction

नेत्र अनुसंधान में, रेटिना का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार के मॉडल उपलब्ध हैं, जिनमें प्राथमिक रेटिना सेल संस्कृतियां, रेटिना-व्युत्पन्न सेल लाइनें, रेटिना ऑर्गेनॉइड,और वीवो पशु मॉडल1,2, 3,4,5शामिल हैं। हालांकि, इनमें से प्रत्येक मॉडल कमियों से ग्रस्त है। उदाहरण के लिए, कोशिकाएं अलगाव में बढ़ती हैं जबकि रेटिना सेल-टू-सेल इंटरैक्शन की एक भीड़ के साथ एक जटिल नेटवर्क है। इस प्रकार, अलग-थलग कोशिका संस्कृतियों का व्यवहार पूरे ऊतक में देखे जाने की तुलना में कृत्रिम होने की संभावना है। इस समस्या को इन विट्रो विभेदित रेटिना ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके उपचारित किया जा सकता है, जिसका उपयोग विकास और बुनियादी जीव विज्ञान6का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। फिर भी, आज की तारीख में, रेटिना ऑर्गेनॉइड पीढ़ी अभी भी समय लेने वाली, श्रम-प्रधान है, और प्रजनन के मुद्दों से ग्रस्त है, ऑर्गेनॉइड से पहले पर्याप्त विकास कार्य की आवश्यकता होती है अनुवाद रेटिना अनुसंधान के लिए उपयोग किया जा सकता है। अंत में, जीवित जानवरों पर अध्ययन, जबकि यकीनन मॉडल है कि नेत्र अनुसंधान की आवश्यकताओं के निकटतम आता है, मजबूत नैतिक चिंताओं के साथ जुड़े रहे हैं । सेल कल्चर सिस्टम की दक्षता और वीवो पशु मॉडल में वास्तविक जीवन की स्थिति के बीच एक अच्छा समझौता ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियां हैं। ऐसी संस्कृतियां पशु पीड़ा को भी कम करती हैं क्योंकि वीवो हस्तक्षेपों में कोई नहीं किया जाता है।

विभिन्न प्रजातियों के रेटिना एक्सप्लांट्स को बनाने के लिए कई तरीके बताए गएहैं। हमारा प्रोटोकॉल माउस न्यूरोरेटिना के अलगाव के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है जो इसके रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) के साथ होता है। यह तकनीक चूहे रेटिनासंस्कृतियोंके लिए भी उपयुक्त होगी । न्यूरोरेटीना की संस्कृति अपने आरपीई के साथ मिलकर सफलता के लिए बड़ा महत्व रखता है। आरपीई रेटिना के लिए आवश्यक कार्य करता है: पोषक तत्वों, आयनों, पानी, प्रकाश के अवशोषण और फोटोऑक्सीडेशन के खिलाफ सुरक्षा, 11-सीआईएस-रेटिना में सभी-ट्रांस-रेटिना का पुनः आइसोमराइजेशन, जो दृश्य चक्र के लिए महत्वपूर्ण है, शेड फोटोरिसेप्टर झिल्ली का फागोसिटोसिस, और रेटिना10 केसंरचनात्मक अखंडता के लिए आवश्यक कारकों का रहस्य। आरपीई को बनाए रखने से रेटिना को लंबेसमयतक व्यवहार्य रखते हुए फोटोरिसेप्टर बाहरी और आंतरिक खंडों के सफल विकास की अनुमति देता है। नीचे वर्णित प्रक्रिया रेटिना की हिस्टोटीपिक और शारीरिक विशेषताओं को कम से कम दो सप्ताह12तक सुरक्षित रखती है . इसके अलावा, सीरम-मुक्त, एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम में ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट्स को बनाने से अज्ञात पदार्थों की उपस्थिति से बचा जाता है और परिणामों की सीधी व्याख्या12सक्षम बनाती है।

रेटिना विकासऔर पतन7, 13,14पर हमारे ज्ञान में सुधार के लिए ऑर्गेनोटीपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियां आवश्यक रही हैं । हम यहां दिखाते हैं कि वे औषधीय स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण भी हैं और उन्हें मधुमेह रेटिनोपैथी सहित विभिन्न प्रकार के रेटिना रोगों को मॉडल करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

Protocol

पशु संरक्षण के जर्मन कानून के § 4 के अनुरूप पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और पशु संरक्षण पर तुबिनजेन विश्वविद्यालय समिति द्वारा अनुमोदित किया गया(Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; रजिस्ट्रेशन नं. AK02/19M) । इस अध्ययन में, रेटिना जंगली प्रकार (डब्ल्यूटीई) और आरडी 1 चूहों से प्राप्त किए गए थे, बाद में वंशानुगत रेटिना अध: पतन15के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता मॉडल है। चूहों को मानक सफेद चक्रीय प्रकाश व्यवस्था के तहत रखे गए थे, भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच थी, और लिंग के बावजूद उपयोग किया गया था।

1. चेकलिस्ट

  1. बाँझ स्थितियों को सुनिश्चित करने और 70% इथेनॉल के साथ लेमिनार वायु प्रवाह हुड को दूषित, साफ और कीटाणुरहित करने से बचने के लिए। रेटिना संस्कृतियों के नशे को रोकने के लिए इथेनॉल को पूरी तरह से वाष्पित होने देना सुनिश्चित करें।
  2. उपयोग से पहले ऑटोक्लेव उपकरण (जैसे, कैंची, संदंश, और नेत्र माइक्रोस्कोप स्क्रैपिंग चम्मच)।
  3. बाँझ परिस्थितियों में एक लैमिनार-फ्लो हुड के तहत निम्नलिखित मीडिया को पहले से तैयार करें: बेसल आर 16 मध्यम (बीएम) (4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है), 20% भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस) (उसी दिन उपयोग) के साथ बीएम, 0 के साथ बीएम.12% प्रोटीन के (44 mAnson U/mg) समाधान (एक ही दिन का उपयोग) और पूरक (सीएम) के साथ पूरा R16 माध्यम के रूप में Romijn16 द्वारा वर्णित (3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है) (टेबल S1 देखें, S2, और S3)।
  4. प्रोटीन के घोल को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें ताकि इसे एक्टिवेट किया जा सके और इसे स्टेप 2.5 में इस्तेमाल किया जा सके।

2. तैयारी

  1. प्रसव के बाद के दिन (पी) 5 में डेपुटेशन द्वारा rd1/WTपशु का बलिदान । P11 से पुराने जानवरों के लिए, स्थानीय पशु संरक्षण विनियमों के अनुसार, सीओ2 और/या ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करें ।
  2. जानवर की उम्र के आधार पर, परमाणु से पहले, यदि आवश्यक हो, तो संदंश का उपयोग करके आंख के ढक्कन खोलें और नीचे आंख को छूने या खरोंच किए बिना आंख के ढक्कन को बहुत सावधानी से अलग करें।
  3. घुमावदार संदंश का उपयोग करके आंखों को तेजी से स्टीरियोस्कोप के नीचे से बाहर करें।
  4. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए बीएम में आंखों को इनक्यूबेट करें।
  5. पहले से गरम बीएम में आंखों को इनक्यूबेट करें, 0.12% प्रोटीन के साथ 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  6. बाँझ स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए एक लैमिनार वायु प्रवाह हुड के अंदर निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें। प्रोटीन के को निष्क्रिय करने के लिए, 20% एफसीएस युक्त बीएम में आंखों को स्थानांतरित करें और आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. एक स्टीरियोस्कोप के नीचे आंखों को विच्छेदन करें, जो कि आरटी में ताजा बीएम युक्त पेट्री डिश में है। इक्यूनेशन के बाद जितनी जल्दी हो सके विच्छेदन शुरू करें। अब इस बार है, यह रेटिना विच्छेदन करने के लिए कठिन है, आंखें बहुत नरम हो रही है ।
    1. संदंश के साथ, ऑप्टिक तंत्रिका से आंख पकड़ो। ठीक कैंची का उपयोग करके, कॉर्निया में एक छोटा सा चीरा बनाएं जहां से कॉर्निया, कोरॉयड और स्क्लीरा को 2 जोड़ी ठीक संदंश(चित्रा 1 कदम ए-सी) का उपयोग करके धीरे-धीरे छीला जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कॉर्निया में पहला चीरा लगाने के लिए एक संकीर्ण गेज कैनुला का उपयोग करें और फिर खोलने में कैंची ब्लेड में से एक डालें।
    2. लेंस को बारीक संदंश के साथ पकड़ें। पहले लोगों के लिए लंबवत संदंश की एक दूसरी जोड़ी रखें ताकि पहला संदंश दूसरे के 2 शंखों के बीच हो। आंख के कप से लेंस निकालने के लिए खींचो। यदि विट्रियस और सिलियरी बॉडी अभी भी रेटिना से जुड़ी हुई है, तो उन्हें ध्यान से हटा दें(चित्रा 1 चरण डी)।
      नोट: चरण 2.7.1 और 2.7.2 अभ्यास की आवश्यकता है और रेटिना को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधानी सुनिश्चित करें।
    3. रेटिना लंबवत को चार बिंदुओं में अपने किनारों पर काट लें, चार पत्ती वाले क्लोवर आकार(चित्रा 1 कदम ई-एफ) बनाएं।
    4. 1 एमएल टिप के मोटे तौर पर कट बेस के साथ एक पिपेट का उपयोग करना, रेटिना को मध्यम की फांसी की बूंद में पकड़ें और इसे 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में रखे कल्चर डिश फिल्टर डालने में स्थानांतरित करें। आरपीई परत झिल्ली(चित्रा 1 कदम जी) का सामना करना चाहिए।
    5. एक पिपेट का उपयोग करके, डालने से अतिरिक्त माध्यम को सावधानी से हटा दें।
    6. कुएं के किनारों से, प्रति अच्छी तरह से सीएम के 1 एमसीएल जोड़ें और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। रेटिना को माध्यम में न डूबें क्योंकि इससे ऑक्सीजन में कमी आएगी और ऊतक अध: पतन होगा। एक्सप्लांट तरल और हवा के बीच इंटरफेस पर रहना चाहिए, जो केवल पानी की सतह तनाव द्वारा बनाई गई तरल की एक पतली फिल्म द्वारा कवर किया जाता है।
  8. एक्सप्लांटेशन प्रक्रिया के बाद वसूली की सुविधा के लिए पहले 48 घंटे के लिए रेटिना एक्सप्लांट को अविचलित छोड़ दें।
  9. हर दूसरे दिन (48 घंटे) माध्यम बदलें। प्रत्येक कुएं से माध्यम के 700 माइक्रोन को त्यागें और कुएं में ताजा सीएम के 900 माइक्रोन जोड़ें। इस तरह वाष्पीकरण से खोए गए मध्यम की मात्रा वसूल की जाती है और रेटिना एक्सप्लांट पिछले 48 एच में उत्पादित कुछ न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों को रखता है।
  10. संभावित संदूषण (यानी, माध्यम के रंग में परिवर्तन) को नियंत्रित करने और मूल्यांकन करने के लिए संस्कृतियों के साथ एक अलग और बंद माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में हटाए गए माध्यम को इनक्यूबेट करें।
    नोट: रेटिना एक्सप्लांट्स को संस्कृति में कम से कम 2 सप्ताह12तक रखा जा सकता है ।

3. खेती के बाद

नोट: एक्सप्लांट का उपयोग विभिन्न प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों (पश्चिमी दाग, हिस्टोलॉजी, पूरे माउंट, आनुवंशिक विश्लेषण, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) के लिए किया जा सकता है। आवेदन के आधार पर, ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट को फ्रोजन, lysed, या क्रायोस्ेक्शनिंग के लिए तैयार किया जा सकता है। नीचे दिए गए कदम हिस्टोलॉजिकल तैयारी का वर्णन करते हैं।

  1. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ 45-न्यूनतम निर्धारण करें, इसके बाद क्रमिक सुक्रोज क्रायोप्रोप्रोटेक्शन (10 मिनट के लिए 10% सुक्रोज, 20 मिनट के लिए 20% और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 30% (आरटी) या रात भर (ओन) 4 डिग्री सेल्सियस पर) । इन बफ़र्स को सीधे कुएं में जोड़ें।
  2. रेटिना एक्सप्लांट्स के चारों ओर झिल्ली काटें।
  3. जमे हुए ऊतकों के लिए माध्यम में झिल्ली और रेटिना ऊतक दोनों एम्बेड।

Figure 1
चित्रा 1:ऑर्गेनोटीपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों की तैयारी के लिए कदम-दर-कदम प्रक्रिया। (क)माउस आंखों को नाभिित किया जाता है और रेटिना और आरपीई से स्क्लेरा और कोरॉइड को अलग करने की अनुमति देने के लिए प्रोटीन के समाधान में स्थानांतरित किया जाता है। स्क्लेरा/कोरॉयड लेयर में एक छोटा सा कट पेश किया जाता है । (ख)स्क्लेरा/कोरॉइड लेयर को छीलने के लिए दो संदंश का इस्तेमाल किया जाता है । (ग)छीलने के दौरान काली कोरॉयड परत देखी जा सकती है। रेखांकित डार्क रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) आंखों की पुतली से जुड़ा रहता है। ऑप्टिक नर्व के साथ स्क्लेरा और कोरॉइड को हटा दिया जाता है। (घ)लेंस और विट्रेस को संदंश के साथ निकाला जाता है।  शेष सिलियरी शरीर को हटा दिया जाता है। (ई)रेटिना एक कटोरा की तरह आकार बरकरार रखती है । (च)एक डिश में खेती के लिए रेटिना को समतल करने के लिए रेटिना के आसपास बराबर दूरी में 4 कट्स कैंची से बनाए जाते हैं, जिससे यह क्लोवर जैसी आकृति का रूप दे देता है । रेटिना संस्कृति को एक झिल्ली संस्कृति में स्थानांतरित किया जाता है जिसमें 6-अच्छी प्लेट में कटौती 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग किया जाता है। रेटिना अभी भी कटोरा आकार के कुछ बरकरार रखती है । हालांकि, रेटिना के आसपास के अतिरिक्त तरल को हटाने पर, यह एक प्लैनर संरचना के लिए प्रकट होगा। (जी)संस्कृति झिल्ली सेटअप में, रेटिना संस्कृति पूर्ण R16 माध्यम के समाधान के शीर्ष पर एक असुरक्षित पॉली कार्बोनेट (पीसी) झिल्ली पर आराम कर रही है। व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, संस्कृति को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत बाँझ इनक्यूबेटर में रखा जाना चाहिए, और माध्यम को हर 48 घंटे प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Representative Results

प्रोटोकॉल का पालन करने के बाद, विच्छेदित और सुसंस्कृत रेटिना एक्सप्लांट अपने सामान्य ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करते हैं, अलग परतों के साथ, आरपीई से गैंगलियन सेल लेयर (जीसीएल) तक, जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है। बाहरी परमाणु परत (ओएनएल) और आंतरिक परमाणु परत (आईएनएल) का आकार ज्यादातर 2-3 सप्ताह के लिए स्थिर रहा, धीरे-धीरे प्रगति करने वाली सेल हानि और इन परतों के क्रमिक पतले होने से अधिक और अधिक स्पष्ट होता जा रहा है यदि खेती की अवधि 4 सप्ताह और उससे आगे तक लंबी है। जीसीएल में, इसके विपरीत, ऑप्टिक तंत्रिका के एवोटॉमी के कारण, एक चिह्नित पतला आमतौर पर खेती के पहले 4 दिनों के भीतर मनाया जाता है। बाद में, जीसीएल में शेष सेल आबादी (ज्यादातर विस्थापित अमैकरीन कोशिकाएं) 3-4 सप्ताह17,18, 19के लिए व्यवहार्य बनीरहेंगी।

Figure 2
चित्रा 2:रेटिना एक्सप्लांट संस्कृति में पाए जाने वाले सेल प्रकार। P11 में रेटिना एक्सप्लांट संस्कृति rd1 उत्परिवर्ती(ए)और डब्ल्यूटी जानवरों(बी)से प्राप्त DAPI (बाएं, नीले), रॉड फोटोरिसेप्टर्स (केंद्र, लाल) और Müller कोशिकाओं (दाएं, हरे) के साथ परमाणु धुंधला दिखा । न्यूक्लियर स्टेनिंग रेटिना की सभी प्रमुख सेलुलर परतों जैसे रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई), बाहरी परमाणु परत (ओएनएल), इनर न्यूक्लियर लेयर (आईएनएल) और गैंगलियन सेल लेयर (जीसीएल) पर प्रकाश डालता है। परमाणु परतों में विशिष्ट कोशिका प्रकार, जैसे छड़ और मुलर कोशिकाएं, क्रमशः26 में अल्फा गिरफ्तारी और ग्लूटामाइन संश्लेषण27 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलेबल हैं। (ग)रेटिना की   निरंतरता, एकीकरण और विकास को उजागर करने वाले DAPI धुंधला के साथ, एक पूरेrd1 माउस रेटिना की पूरी लंबाई अनुभाग दिखाता है। इन रेटिना को 6 दिन तक सुसंस्कृत किया गया। प्रक्रिया विवरण: आरडी 1 या डब्ल्यूटी जानवरों से प्राप्त रेटिना और आरपीई को पी 5 में अलग-थलग कर दिया गया था और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में सुसंस्कृत किया गया था, जब तक कि हर 48 घंटे में मध्यम परिवर्तन के साथ P11 नहीं होता। संस्कृतियों P11 और क्रायोसेक्शन में 4% पीएफए के साथ तय किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

सीरम मुक्त माध्यम और निरंतर इन विट्रो वातावरण प्रायोगिक स्थितियों पर पूर्ण नियंत्रण रखने की अनुमति देते हैं। यहां, हम इस प्रोटोकॉल के विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए दो उदाहरण प्रदान करते हैं।
पहला उदाहरण दवा परीक्षण या स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए रेटिना एक्सप्लांट का उपयोग करने की संभावना दिखाता है। ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों को जंगली प्रकार (डब्ल्यूटीई) और आरडी 1 माउस मॉडल से तैयार किया गया था। उत्तरार्द्ध रेटिना अध: पतन15के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता मॉडल है । आरडी 1 माउस रेटिना में, ओएनएल डिजनरेशन रॉड फोटोरिसेप्टर्स6,20में सीजीएमपी के असामान्य रूप से उच्च स्तर से शुरू होता है। अत्यधिक सीजीएमपी चक्रीय न्यूक्लियोटाइड गेटेड आयन चैनलों (सीएनजीसी) और सीजीएमपी-निर्भर प्रोटीन किनेज (पीकेजी) की गतिविधि में वृद्धि का कारण बनता है, जिससे सेल डेथ21हो जाती है । सीजीएमपी (चक्रीय न्यूक्लियोटाइड #3) के लिए एक संरचनात्मक एनालॉग के साथ आरडी 1 माउस रेटिना का उपचार; सीएन003), जो पीकेजी और सीएनजीसी दोनों को लक्षित करता है, का परीक्षण किया गया। P5 में विस्तार के बाद, चित्रा 3A में वर्णित उपचार प्रतिमान का पालन किया गया । एक्सप्लांट संस्कृतियों को P11 में 4% पीएफए के साथ तय किया गया था और क्रायोसेक्शनिंग(चित्रा 3 ए)के लिए तैयार किया गया था। इलाज, गैर इलाज (NT), और WT नमूनों से हिस्टोलॉजिकल वर्गों की सेल मौत का आकलन करने के लिए, एक टर्मिनल deoxynucleotidyl transferase dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) परख22 प्रदर्शन किया गया था । ट्यूनल लेबल कोशिकाओं के विश्लेषण ने आरडी1 अनुपचारित नमूनों के ओएनएल में मरने वाली कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत दिखाया, जबकि CN003 50 μM23 (चित्रा 3B)की एकाग्रता पर लागू होने पर आरडी1 माउस फोटोरिसेप्टर्स की रक्षा की।

मधुमेह की लगातार जटिलता मधुमेह रेटिनोपैथी है, एक चकाचौंध रोग है जो ईमानदारी से पशु मॉडल5में पुन: पेश करने के लिए मुश्किल है । दूसरा उदाहरण टाइप-2 मधुमेह मेलिटस (T2DM)24की नकल करने वाली स्थितियों के तहत रेटिना सेल व्यवहार्यता की विशेषता के लिए ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों के उपयोग पर प्रकाश डाला गया है । यहां, हम ग्लाइकोलिसिस अवरोधक 2-deoxy-ग्लूकोज (2-डीजी)25 के 20 mM का इस्तेमाल किया और यह P10 से P11 के लिए 24 घंटे के लिए संस्कृति माध्यम के लिए प्रशासित । हम बताते हैं कि इस तरह के इन विट्रो नकली मधुमेह की स्थिति के लिए डब्ल्यूटीई रेटिना एक्सप्लांट्स को अधीन करने से रेटिना(चित्रा 3C)की व्यापक न्यूरोनल सेल मौत हो जाती है। बदले में इस प्रतिमान तो इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, अपक्षयी तंत्र का अध्ययन करने के लिए या एक मधुमेह के संदर्भ में रेटिनो सुरक्षात्मक उपचार का परीक्षण करने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3:ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों के अनुप्रयोगों के लिए दो उदाहरण। (ए)प्रक्रिया विवरण: रेटिना और आरपीई rd1 या WT जानवरों से प्राप्त प्रसव के बाद के दिन (पी) 5 में अलग-थलग थे और ऊपर वर्णित के रूप में सुसंस्कृत, हर ४८ घंटे में एक मध्यम परिवर्तन के साथ । P7 और P9 में, खर्च किए गए माध्यम को छोड़ दिया गया था और 50 माइक्रोन की एकाग्रता पर सक्रिय यौगिक युक्त ताजा सीएम को प्लेट में जोड़ा गया था। संस्कृतियों P11 और क्रायोसेक्शन में 4% पीएफए के साथ तय किया गया । (ख) rd1 रेटिना पर यौगिक परीक्षण । धाराओं को डब्ल्यूटी, उपचारित (003), और गैर-उपचारित (एनटी) ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों से प्राप्त किया गया था। ट्यूनल परख (लाल) सेल मौत के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था। DAPI (नीला) के साथ परमाणु धुंधला । बार ग्राफ में दिखाया गया परिमाण डब्ल्यूटी, आरडी 1 एनटी और आरडी 1 003 स्थिति में मरने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाता है। यौगिक 003 के साथ उपचार काफी कम rd1 फोटोरिसेप्टर सेल मौत। (ग)डब्ल्यूटी रेटिना पर टाइप-2 डायबिटीज मेलिटस (टी2डीएम) का सिमुलेशन 2-डिऑक्सी-ग्लूकोज (2-डीजी) उपचार का उपयोग करके। एनटी और टी2डीएम नमूनों पर ट्यूनल परख का प्रदर्शन किया गया । मात्राकरण कोशिका मृत्यु में अत्यधिक महत्वपूर्ण वृद्धि को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल परिभाषित R16 माध्यम में बरकरार आरपीई के साथ माउस रेटिना की ऑर्गेनोटिपिक एक्सप्लांट संस्कृतियों का वर्णन करता है, सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त । यह प्रोटोकॉल मूल रूप से 1980 के दशक के उत्तरार्ध में7,28 में विकसित किया गया था और तब से इसे लगातार परिष्कृत किया गया है 6 ,11,12. उल्लेखनीय अनुप्रयोगों में वंशानुगत रेटिना अध: पतन के तंत्र में अध्ययन और रेटिनोप्रोटेक्टिव दवाओं की पहचान23,29,30शामिल हैं ।

सफल प्रयोग के लिए कुछ महत्वपूर्ण बातों को ध्यान में रखने की जरूरत है। संस्कृतियों की गुणवत्ता को बढ़ाने में मदद करने के लिए यहां कुछ महत्वपूर्ण समस्या निवारण बिंदु हैं। सबसे पहले, रेटिना संस्कृतियों अत्यधिक तह और/या थालीगठन 31प्रदर्शित कर सकते हैं । यह एक्सप्लांटेशन प्रक्रिया के दौरान एक संदंश के साथ रेटिना को छूने के कारण हो सकता है। इसके अलावा, सिलियरी शरीर को एक्सप्लांट से पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए, क्योंकि यह संस्कृति के दौरान रेटिना तह को बढ़ा सकता है। दूसरा, एक फांसी ड्रॉप में अच्छी तरह से थाली में रेटिना के हस्तांतरण के दौरान, यदि रेटिना झिल्ली गलत पक्ष नीचे चेहरे, यह पिपेट टिप से फांसी ड्रॉप में रखने के लिए और बहुत धीरे में और टिप के बाहर मध्यम धक्का (फांसी ड्रॉप अलग बिना) रेटिना के आसपास फ्लिप करने के लिए । अंत में, यदि आरपीई रेटिना से स्क्लेरा और डिटैच से जुड़ा रहता है, तो यह स्क्लेरा के अपर्याप्त पूर्वचच के कारण सबसे अधिक संभावना है। यह समस्या विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकती है जब पुराने जानवरों या गैर-कृंतक प्रजातियों (जैसे, सूअर) से आंखों के साथ काम करते हैं और प्रोटीनक के एकाग्रता को बढ़ाकर हल किया जा सकता है।

ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों का संचालन एक जटिल प्रक्रिया है जिसके लिए पर्याप्त प्रशिक्षण और अनुभव की आवश्यकता होती है। प्रशिक्षण की कमी रेटिना एक्सप्लांट की गुणवत्ता में परिवर्तनशीलता का कारण बन सकती है। इन कारणों से, व्यवहार्यता और प्रजनन क्षमता की निगरानी और सत्यापन करना महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, ट्यूनल परख के साथ सेल मृत्यु की दर। एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम का उपयोग रेटिना एक्सप्लांट बैक्टीरिया और कवक द्वारा संदूषण के लिए असुरक्षित बनाता है। इस जोखिम को कम करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि वास्तव में एसेप्टिक परिस्थितियों में काम करने के लिए विशेष देखभाल की जाती है। विट्रो रेटिना की खेती की एक और सीमा फिजियोकेमिकल वातावरण में अंतर है जब वीवो रेटिना (जैसे, कोरॉयडल और रेटिना रक्त की आपूर्ति, ऑक्सीजन और ग्लूकोज का स्तर, इंट्राओकुलर दबाव, वित्रीय की संरचना) की तुलना में। एक सतत पर्फ्यूजन सिस्टम, शायद एक समर्पित बायोरिएक्टर32 में एम्बेडेड इस मॉडल को वीवो स्थिति के करीब बना सकता है। इसके अलावा, रेटिना विच्छेदन के दौरान ऑप्टिक तंत्रिका की अक्षांती गैंगलियन सेल मौत का कारण बन जाएगी, जो तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकती है8। इसलिए, यह सिफारिश की जाती है कि एक्सप्लांट को विशिष्ट हेरफेर या उपचार के अधीन होने से पहले विट्रो में कम से कम 2 दिनों के लिए खेती की स्थिति के अनुकूल होने के लिए छोड़ दिया जाए।

वर्णित विधि आमतौर पर अपरिपक्व रेटिना ऊतकों पर की जाती है, जो विट्रो7,33में 4 सप्ताह तक अच्छी तरह से जीवित रह सकती है। हालांकि, प्रक्रिया वयस्क रेटिना की खेती सहित विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल है। यद्यपि विभिन्न प्रकाशित दृष्टिकोण ों में वयस्क रेटिना के बिना उसके आरपीई34,35के अलगाव का वर्णन किया गया है , लेकिन विच्छेदन से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे तक के लिए पापीन समाधान के साथ इनक्यूबेशन आरपीई को वयस्क माउस36से प्राप्त होने पर भी रेटिना से जुड़ा रहने की अनुमति देता है।

सीरम मुक्त माध्यम और रासायनिक रूप से परिभाषित इन विट्रो वातावरण प्रायोगिक स्थितियों के पूरी तरह से परिभाषित और प्रजनन योग्य हेरफेर के लिए प्रदान करता है। इसलिए, ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियां नेत्र विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में मूल्यवान उपकरण हैं, और रेटिना रोगों 37, रेटिना विकास38, 39,रेटिना स्टेम सेल थेरेपी40,आनुवंशिक संशोधनों41,और औषधीय स्क्रीनिंग का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। दवा परीक्षण के एक विशिष्ट उदाहरण के रूप में, यहां हमने एक सीजीएमपी एनालॉग (CN003) का परीक्षण करने के लिए रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों का उपयोग किया, जिसे विरासत में मिली रेटिना बीमारी23 (चित्रा 3B)के लिए पशु मॉडल में फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु को कम करने के लिए जाना जाता है। इस तकनीक का एक अन्य संभावित अनुप्रयोग चित्रा 3 सीमें वर्णित है , जो यह दर्शाता है कि मधुमेह की स्थितियों का अनुकरण करने के लिए ऊतक पर्यावरण के सटीक नियंत्रण का दोहन कैसे किया जा सकता है24. पूरे संस्कृति अवधि में ऊतक वास्तुकला के संरक्षण के कारण, ऑर्गेनोटीपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियां इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों के लिए भी उपयुक्त हैं। रेटिना एक्सप्लांट्स पर न्यूरोनल कार्यक्षमता की जांच पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग42 और मल्टी-इलेक्ट्रोड-ऐरे (एमईए) रिकॉर्डिंग33,43का उपयोग करके की गई है। उत्तरार्द्ध एक ही समय में न्यूरोनल आबादी की विद्युत गतिविधि की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है और संस्कृति की स्थितियों में फोटोरिसेप्टर और गैंगलियन सेल कार्यक्षमता की विशेषता के लिए शोषण किया गया है। एक व्यापक परिप्रेक्ष्य में, ऑर्गेनोटिपिक एक्सप्लांट संस्कृति प्रणालियों को प्री-क्लीनिकल शोध में भी लागू किया जा सकता है, जहां हाइपोथर्मिया44की चिकित्सीय प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक्सप्लांट संस्कृतियों का उपयोग किया जाता था।

ऑर्गेनोथिपिक एक्सप्लांट ̈क्यूपिंग तकनीक प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल है और, जब वीवो प्रयोगों में इसी की तुलना में, कम खर्चीला और समय लेने वाला है, और जीवित पशु अध्ययन से संबंधित नैतिक चिंताओं से बचा जाता है। प्रायोगिक स्थितियों पर सटीक नियंत्रण और आरपीई और ऊतक जटिलता के संरक्षण विधि रेटिना शरीर विज्ञान और रोगविज्ञान पर हमारे ज्ञान में सुधार करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाने के लिए और कई प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों को सक्षम ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध कार्य को यूरोपीय संघ(ट्रांसएमएड)से वित्तीय सहायता प्राप्त हुई । H2020-MSCA-765441), जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG; PA1751/8-1, 10-1) और चीन छात्रवृत्ति परिषद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotin Sigma B4639
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid) Sigma T1395
BSA Sigma B4639
CDP-Choline-Na Sigma 30290
Corticosterone Sigma C2505
CuSO4 × 5H2O Sigma C8027
DL-Tocopherol Sigma T1539
Ethanolamine Sigma E0135
FCS Sigma F7524
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm SARSTEDT 83.3942.101 for Basal Medium
Forceps  F.S.T 15003-08
Glutamine Sigma G8540
Glutathione Sigma G6013
Insulin  Sigma I6634
L-CysteineHCl Sigma C7477
Linoleic Acid Sigma L1012
Linolenic Acid Sigma L2376
MnCl2 x 4H2O Sigma M5005
Na-pyruvate Sigma P3662
NaSeO3 x 5H2O Sigma S5261
Ophthalmic microscope scaping spoon F.S.T. 10360-13
Progesteron Sigma P8783
Proteinase K  MP Biomedicals 21935025 44 mAnson U/mg
R16 Gibco 07491252A
Retinol Sigma R7632
Retinyl acetate  Sigma R7882
Scissors F.S.T 15004-08
Sterile filter 0.22µm MILLEX GP SLGP033RS for supplements
T3  Sigma T6397
Tocopherylacetate Sigma T1157
Transferrin Sigma T1283
Transwell permeable supports Corning 3412
Vitamin B1 Sigma T1270
Vitamin B12 Sigma V6629
Vitamin C Sigma A4034

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तंत्रिका विज्ञान अंक 165 न्यूरोरेटीना आरपीई ऑर्गेनोटिपिक एक्सप्लांट संस्कृतियां सीरम-मुक्त माध्यम माउस अंग संस्कृति
बरकरार रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम के साथ ऑर्गैयपिक माउस रेटिना एक्सप्लांट की लंबी अवधि, सीरम-मुक्त खेती
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Belhadj, S., Tolone, A.,… More

Belhadj, S., Tolone, A., Christensen, G., Das, S., Chen, Y., Paquet-Durand, F. Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (165), e61868, doi:10.3791/61868 (2020).

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