Protokollen beskriver organotypiske utvisning av mus neuronetthinne, dyrket sammen med sin retinal pigment epitel (RPE), i R16 definert medium, fri for serum og antibiotika. Denne metoden er relativt enkel å utføre, billigere og tidkrevende sammenlignet med in vivo-eksperimenter, og kan tilpasses mange eksperimentelle applikasjoner.
I oftalmisk forskning er det et sterkt behov for in vitro-modeller av nevroretina. Her presenterer vi en detaljert protokoll for organotypisk dyrking av musens nevronetthinne med intakt retinal pigment epitel (RPE). Avhengig av forskningsspørsmålet kan netthinner isoleres fra ville dyr eller fra sykdomsmodeller, for å studere for eksempel diabetisk retinopati eller arvelig retinal degenerasjon. Øyne fra tidlig barseldag 2-9 dyr er utdannet under aseptiske forhold. De er delvis fordøyd i proteinase K for å tillate en løsrivelse av choroid fra RPE. Under stereoskopet er det laget et lite snitt i hornhinnen og skaper to kanter hvor choroid og sclera forsiktig kan skrelles av fra RPE og neuroretina. Linsen fjernes deretter, og øyemuslingen kuttes i fire punkter for å gi den en fire-kilet form som ligner et kløverblad. Vevet overføres til slutt i en hengende dråpe inn i en cellekulturinnsats som holder en polykarbonatkulturerende membran. Kulturene opprettholdes deretter i R16 medium, uten serum eller antibiotika, under helt definerte forhold, med en middels endring annenhver dag.
Prosedyren som er beskrevet muliggjør isolering av netthinnen og bevaring av sin normale fysiologiske og histotypiske kontekst for modningsperioder på minst 2 uker. Disse funksjonene gjør organotypiske retinal explant-kulturer til en utmerket modell med høy prediktiv verdi, for studier i retinal utvikling, sykdomsmekanismer og elektrofysiologi, samtidig som de muliggjør farmakologisk screening.
I oftalmisk forskning er en rekke modeller tilgjengelige for å studere netthinnen, inkludert primære netthinnecellekulturer, netthinneavledede cellelinjer, netthinneorganoider og in vivo dyremodeller1,2,3,4,5. Imidlertid lider hver av disse modellene av ulemper. For eksempel vokser celler isolert mens netthinnen er et komplekst nettverk med en rekke celle-til-celle interaksjoner. Dermed vil oppførselen til isolerte cellekulturer sannsynligvis være kunstig sammenlignet med det som observeres i et helt vev. Dette problemet kan delvis løses ved hjelp av in vitro differensierte retinal organoider, som kan brukes til å studere utvikling og grunnleggende biologi6. Likevel, per i dag, er retinal organoid generasjon fortsatt tidkrevende, arbeidsintensiv, og lider av reproduserbarhetsproblemer, og krever betydelig videre utviklingsarbeid før organoider kan brukes til translasjonell retinal forskning. Til slutt er studier på levende dyr, mens uten tvil modellen som kommer nærmest kravene til oftalmisk forskning, forbundet med sterke etiske bekymringer. Et godt kompromiss mellom effektiviteten til cellekultursystemer og den virkelige situasjonen til in vivo dyremodeller er organotypiske retinal explant kulturer. Slike kulturer reduserer også dyrelidelse siden ingen in vivo-intervensjoner utføres.
Flere metoder er beskrevet for å dyrke retinal explants fra forskjellige arter5,7,8. Vår protokoll beskriver en teknikk for isolering av musen neuroretina sammen med sin retinal pigment epitel (RPE). Denne teknikken vil også være egnet for rotte retinal kulturer9. Kulturen til neuroretina sammen med sin RPE er av stor betydning for suksess. RPE utfører viktige funksjoner for netthinnen: transport av næringsstoffer, ioner, vann, absorpsjon av lys og beskyttelse mot fotooksidasjon, re-isomerisering av all-trans-retinal i 11-cis-retinal, som er avgjørende for den visuelle syklusen, fagocytose av skur fotoreseptormembraner og sekresjon av essensielle faktorer for den strukturelle integriteten til netthinnen10. Vedlikehold av RPE tillater en vellykket utvikling av fotoreseptor ytre og indre segmenter, og holder netthinnen levedyktig i lengre tid11. Prosedyren beskrevet nedenfor bevarer de histotypiske og fysiologiske egenskapene til netthinnen i minst to uker12. Videre unngår culturing de organotypiske retinal explants i serumfritt, antibiotikafritt medium tilstedeværelsen av ukjente stoffer og muliggjør en enkel tolkning av resultatene12.
Organotypiske retinal explant kulturer har vært avgjørende for å forbedre vår kunnskap om retinal utvikling og degenerasjon7,13,14. Vi viser her at de også er et nyttig verktøy for farmakologisk screening og at de kan brukes til å modellere en rekke netthinnesykdommer, inkludert diabetisk retinopati.
Protokollen som presenteres beskriver organotypiske eklantkulturer av mus netthinne med intakt RPE i definert R16 medium, fri for serum og antibiotika. Denne protokollen ble opprinnelig utviklet fra slutten av 1980-tallet7,28 og siden da har den blitt kontinuerlig raffinert6,11,12. Bemerkelsesverdige anvendelser inkluderer studier i mekanismene for arvelig retinal degenerasjon og identifisering av retinoprotective legemidler23,29,30.
For et vellykket eksperiment må det tas hensyn til noen viktige hensyn. Her er noen viktige feilsøkingspunkter for å forbedre kvaliteten på kulturer. For det første kan netthinnekulturene vise overdreven folding og/eller rosettdannelse31. Dette kan skyldes berøring av netthinnen med tang under utvisningsprosedyren. Videre må ciliary kroppen fjernes helt fra explant, da dette kan øke retinal folding under kultur. For det andre, under overføringen av netthinnen til brønnplaten i en hengende dråpe, hvis netthinnen vender mot membranen på feil side ned, hold den i dråpen som henger fra pipettespissen og skyv forsiktig mediet inn og ut av spissen (uten å løsne hengende dråpe) for å snu netthinnen rundt. Til slutt, hvis RPE forblir festet til sclera og løsner fra netthinnen, er det mest sannsynlig forårsaket av utilstrekkelig for fordøyelsesbesvær av sclera. Dette problemet kan være spesielt viktig når du arbeider med øyne fra eldre dyr eller ikke-gnagerarter (f.eks. griser) og kan løses ved å øke proteinase K-konsentrasjonen.
Å gjennomføre organotypiske retinal explant kulturer er en kompleks prosedyre som krever tilstrekkelig trening og erfaring. Mangel på trening kan føre til variasjon i kvaliteten på retinal explants. Av disse grunnene er det viktig å overvåke og verifisere levedyktighet og reproduserbarhet, som for eksempel karakteriserer frekvensen av celledød med TUNEL-analysen. Bruken av et antibiotikafritt medium gjør retinal explants sårbare for forurensning av bakterier og sopp. For å minimere denne risikoen anbefaler vi at det tas særlig hensyn til arbeidet under virkelig aseptiske forhold. En annen begrensning av in vitro retinal culturing er forskjeller i fysiokjemisk miljø sammenlignet med in vivo netthinnen (f.eks. koroidal og retinal blodtilførsel, oksygen- og glukosenivåer, intraokulært trykk, sammensetning av glasslegemet). Et kontinuerlig perfusjonssystem, kanskje innebygd i en dedikert bioreaktor32, kan gjøre denne modellen nærmere in vivo-tilstanden. Videre vil axotomien til synsnerven under retinal disseksjon føre til ganglioncelledød, som kan indusere stressresponser8. Derfor anbefales det at utvises for å tilpasse seg til dyrkingsforhold i minst 2 dager in vitro før det blir utsatt for en bestemt manipulasjon eller behandling.
Den beskrevne metoden utføres vanligvis på umoden retinal vev, som kan overleve godt i 4 uker in vitro7,33. Prosedyren er imidlertid skreddersydd for en rekke applikasjoner, inkludert dyrking av voksen netthinne. Selv om forskjellige publiserte tilnærminger beskriver isolasjonen av den voksne netthinnen uten RPE34,35, inkubasjonen med papainoppløsning i opptil 1 time ved 37 °C før disseksjon gjør at RPE kan holde seg festet til netthinnen selv når den er avledet fra en voksen mus36.
Det serumfrie mediet og det kjemisk definerte in vitro-miljøet sørger for en helt definert og reproduserbar manipulering av de eksperimentelle forholdene. Derfor er organotypiske retinal explant kulturer verdifulle verktøy innen oftalmologi og nevrovitenskap, og har blitt brukt til å studere netthinnesykdommer37, netthinneutvikling38,39, retinal stamcellebehandling40, genetiske modifikasjoner41og farmakologisk screening. Som et spesifikt eksempel på legemiddeltesting brukte vi her netthinneutløpskulturer for å teste en cGMP-analog (CN003), kjent for å redusere fotoreseptorcelledød i dyremodeller for arvelig retinal sykdom23 (Figur 3B). En annen mulig anvendelse av teknikken er beskrevet i figur 3C, som illustrerer hvordan den nøyaktige kontrollen av vevsmiljøet kan utnyttes til å etterligne diabetikerforhold24. På grunn av bevaring av vevsarkitektur over hele modningsperioden, er organotypiske retinal explant kulturer også egnet for elektrofysiologiske studier. Neuronal funksjonalitet på retinal explants har blitt undersøkt ved hjelp av patch-clamp opptak42 og multi-elektrode-array (MEA) opptak33,43. Sistnevnte tillater registrering av elektrisk aktivitet av nevronpopulasjoner samtidig og har blitt utnyttet til å karakterisere fotoreseptor- og ganglioncellefunksjonalitet i kulturforhold. I et bredere perspektiv kan de organotypiske eklantkultursystemene også brukes i preklinisk forskning, hvor eklantkulturer ble brukt til å teste den terapeutiske effekten av hypotermi44.
Den organotypiske utvisningsteknikken er relativt enkel å utføre, og sammenlignet med tilsvarende in vivo-eksperimenter er den billigere og tidkrevende, og unngår de etiske bekymringene knyttet til levende dyrestudier. Den nøyaktige kontrollen over eksperimentelle forhold og bevaring av RPE og vevskompleksitet gjør metoden til et verdifullt verktøy for å forbedre vår kunnskap om retinal fysiologi og patofysiologi og muliggjøre mange eksperimentelle applikasjoner.
The authors have nothing to disclose.
Dette forskningsarbeidet fikk økonomisk støtte fra EU (transMed; H2020-MSCA-765441), det tyske forskningsrådet (DFG; PA1751/8-1, 10-1) og Kinas stipendråd.
Biotin | Sigma | B4639 | |
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid) | Sigma | T1395 | |
BSA | Sigma | B4639 | |
CDP-Choline-Na | Sigma | 30290 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
CuSO4 × 5H2O | Sigma | C8027 | |
DL-Tocopherol | Sigma | T1539 | |
Ethanolamine | Sigma | E0135 | |
FCS | Sigma | F7524 | |
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm | SARSTEDT | 83.3942.101 | for Basal Medium |
Forceps | F.S.T | 15003-08 | |
Glutamine | Sigma | G8540 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I6634 | |
L-CysteineHCl | Sigma | C7477 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
MnCl2 x 4H2O | Sigma | M5005 | |
Na-pyruvate | Sigma | P3662 | |
NaSeO3 x 5H2O | Sigma | S5261 | |
Ophthalmic microscope scaping spoon | F.S.T. | 10360-13 | |
Progesteron | Sigma | P8783 | |
Proteinase K | MP Biomedicals | 21935025 | 44 mAnson U/mg |
R16 | Gibco | 07491252A | |
Retinol | Sigma | R7632 | |
Retinyl acetate | Sigma | R7882 | |
Scissors | F.S.T | 15004-08 | |
Sterile filter 0.22µm | MILLEX GP | SLGP033RS | for supplements |
T3 | Sigma | T6397 | |
Tocopherylacetate | Sigma | T1157 | |
Transferrin | Sigma | T1283 | |
Transwell permeable supports | Corning | 3412 | |
Vitamin B1 | Sigma | T1270 | |
Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
Vitamin C | Sigma | A4034 |