Visualisera Calcitonin Genrelaterad peptid immunoreaktiv innervation av råtta hjärnskålen Dura Mater med immunofluorescens och neural spårning
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera rumslig korrelation av calcitonin gen-relaterade peptid (CGRP)-immunoreactive nerv fibrer och blodkärl i hjärnskålen dura mater med hjälp av immunofluorescens och fluorescerande histokemi med CGRP och phalloidin, respektive. Dessutom spårades ursprunget till dessa nerv fibrer bakåtsträvande med en fluorescerande neurala spårämne.
Abstract
Syftet med denna studie var att undersöka fördelningen och ursprunget av calcitonin genrelaterad peptid (CGRP)-immunoreactive sensoriska nerv fibrer av hjärnskålen dura mater med hjälp av immunofluorescens, tredimensionell (3D) återuppbyggnad och bakåtsträvande spårning teknik. Här var nervfibrerna och blodkärlen färgade med immunofluorescens och histokemi tekniker med CGRP och fluorescerande falloider, respektive. Den rumsliga korrelationen av hamburg CGRP-immuoreactive nerv fibrer och blodkärl visades av 3D återuppbyggnad. Under tiden upptäcktes ursprunget till CGRP-immunoreactive nerv fibrer genom neurala spårning teknik med fluorogold (FG) från området runt mellersta meningeal gatan (MMA) i hjärnskålen dura mater till trigeminal ganglion (TG) och massundersökning (C) dorsala rot ganglier (DRGs). Dessutom undersöktes de kemiska egenskaperna hos FG-märkta nervceller i TG och DRGs också tillsammans med CGRP med dubbla immunofluorescenser. Dra nytta av det transparenta helmonteringsprovet och 3D-rekonstruktionen visades att CGRP-immunoreaktiva nervfibrer och falloidinmärkta arterioler löper samman eller separat bildar ett hamburg neurovaskulärt nätverk i en 3D-vy, medan FG-märkta nervceller hittades i oftalmiska, maxillary och mandibular grenar av TG, samt C2-3 DRGs ipsilateral till sidan av spårämne ansökan där några av FG-märkta nervceller presenteras med CGRP-immunoreactive uttryck. Med dessa metoder visade vi de fördelningsegenskaperna hos CGRP-immunoreactive nerv fibrer runt blodkärlen i hjärnskålen dura mater, liksom ursprunget till dessa nerv fibrer från TG och DRGs. Ur metodiskt perspektiv kan det ge en värdefull referens för att förstå den komplicerade neurovaskulära strukturen hos hjärnskålen dura mater under det fysiologiska eller patologiska tillståndet.
Introduction
Hjärnskålen dura mater är det yttersta lagret av hjärnhinnor för att skydda hjärnan och innehåller rikliga blodkärl och olika typer av nervfibrer1,2. Många studier har visat att sensibiliserad hjärnskålen dura mater kan vara den viktigaste faktorn som leder till förekomsten av huvudvärk, som involverar onormal vasodilatation och innervation3,4,5. Således är kunskapen om neurovaskulär struktur i hjärnskålen dura mater viktig för att förstå patogenesen vid huvudvärk, särskilt för migrän.
Även om dura innervation har studerats tidigare med konventionella immunohistokemi, var den rumsliga korrelationen mellan nervfibrer och blodkärl i hjärnskålen dura mater mindrestuderade 6,7,8,9. För att avslöja hamburg neurovaskulära struktur mer detaljerat, calcitonin gen-relaterade peptid (CGRP) och falloidin valdes som markörer för respektive färgning hamburg nerv fibrer och blodkärl i hela mount hjärnskålen dura mater med immunofluorescens och fluorescerande histokemi10. Det kan vara ett optimalt val att få en tredimensionell (3D) syn på neurovaskulär struktur. Dessutom applicerades fluorogold (FG) på området runt mellersta meningeal gatan (MMA) i hjärnskålen dura mater för att bestämma ursprunget till CGRP-immunoreactive nerv fibrer, och spåras till trigeminal ganglion (TG) och massundersökning (C) dorsala rot ganglier (DRGs), medan FG-märkta nervceller undersöktes ytterligare tillsammans med CGRP med hjälp av immunofluorescens.
Syftet med denna studie var att tillhandahålla ett effektivt verktyg för att undersöka den neurovaskulära strukturen i hjärnskålen dura mater för CGRP-immunoreactive innervation och dess ursprung. Genom att dra nytta av den transparenta fullmonterade dura mater och kombinera immunofluorescens, bakåtsträvande spårning, konfokala tekniker och 3D-återuppbyggnad, förväntade vi oss att presentera en ny 3D-vy över den neurovaskulära strukturen i hjärnskålen dura mater. Dessa metodologiska metoder kan ytterligare tjänas för att utforska patogenesen vid olika huvudvärk.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie har vi framgångsrikt visat fördelningen och ursprunget för CGRP-immunoreactive nerv fibrer i hjärnskålen dura mater med hjälp av immunofluorescens, 3D återuppbyggnad och neurala spårning metoder med CGRP antikroppar och FG neurala spårämne, ger histologiska och kemiska bevis för att bättre förstå hamburg neurovaskulära nätverket.
Som det var känt spelar CGRP en kritisk roll i patogenesen vid migrän4,17….
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av projektet national key R&D Program of China (Project Code nr 2019YFC1709103; nr 2018YFC1707804) och National Natural Science Foundation of China (Project Code nr 81774211; nr 81774432; nr 81801561).
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
Referenzen
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neurowissenschaften. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint “Taichong” (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neurowissenschaften. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
