Visualiseren van de Calcitonine Gen-Gerelateerde Peptide Immunoreactieve Innervation van de Rat Cranial Dura Mater met Immunofluorescentie en Neural Tracing
Summary
Hier presenteren we een protocol om ruimtelijke correlatie van calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP)-immunoreactieve zenuwvezels en bloedvaten in de schedel dura mater te visualiseren met behulp van immunofluorescentie en fluorescerende histochemie met respectievelijk CGRP en falloïdine. Bovendien was de oorsprong van deze zenuwvezels retrograde getraceerd met een fluorescerende neurale tracer.
Abstract
Het doel van deze studie was om de verdeling en oorsprong van het calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP)-immunoreactieve sensorische zenuwvezels van de craniale dura mater te onderzoeken met behulp van immunofluorescentie, driedimensionale (3D) reconstructie en retrograde tracing techniek. Hier werden de zenuwvezels en bloedvaten gekleurd met behulp van immunofluorescentie- en histochemietechnieken met respectievelijk CGRP en fluorescerende falloïdine. De ruimtelijke correlatie van dural CGRP-immuoreactieve zenuwvezels en bloedvaten werd aangetoond door 3D-reconstructie. Ondertussen werd de oorsprong van de CGRP-immunoreactieve zenuwvezels gedetecteerd door neurale tracing techniek met fluorogold (FG) van het gebied rond de middelste meningeale slagader (MMA) in de craniale dura mater naar het trigeminus ganglion (TG) en cervicale (C) dorsale wortel ganglia (DRG’s). Bovendien werden de chemische kenmerken van FG-gelabelde neuronen in de TG en DRG’s ook samen met CGRP onderzocht met behulp van dubbele immunofluorescenten. Gebruikmakend van het transparante whole-mount monster en 3D-reconstructie, werd aangetoond dat CGRP-immunoreactieve zenuwvezels en arteriolen met falloidine-label samen lopen of afzonderlijk een dural neurovasculaire netwerk vormen in een 3D-weergave, terwijl de FG-gelabelde neuronen werden gevonden in de oogheelkundige, maxillaire en mandibulaire takken van TG, evenals de C2-3 DRGs ipsilaterale toepassing. Met deze benaderingen hebben we de distributiekenmerken van CGRP-immunoreactieve zenuwvezels rond de bloedvaten in de craniale dura mater aangetoond, evenals de oorsprong van deze zenuwvezels uit TG en DRG’s. Vanuit het perspectief van de methodologie kan het een waardevolle referentie zijn voor het begrijpen van de gecompliceerde neurovasculaire structuur van de craniale dura mater onder de fysiologische of pathologische aandoening.
Introduction
De craniale dura mater is de buitenste laag van hersenvliezen om de hersenen te beschermen en bevat overvloedige bloedvaten en verschillende soorten zenuwvezels1,2. Vele studies hebben aangetoond dat gesensibiliseerde craniale dura mater de belangrijkste factor kan zijn die leidt tot het optreden van hoofdpijn, waarbij de abnormale vasodilatatie en innervatie3,4,5betrokken zijn . De kennis van de neurovasculaire structuur in de craniale dura mater is dus belangrijk voor het begrijpen van de pathogenese van hoofdpijn, vooral voor migraine.
Hoewel de dura-innervatie eerder is bestudeerd met de conventionele immunohistochie , werd de ruimtelijke correlatie van zenuwvezels en bloedvaten in de craniale dura mater minder bestudeerd6,7,8,9. Om de dural neurovasculaire structuur in meer detail te onthullen, werden calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) en phalloïdine geselecteerd als de markers voor respectievelijk het kleuren van de dural zenuwvezels en bloedvaten in de hele schedel dura mater met immunofluorescentie en fluorescerende histochemie10. Het kan een optimale keuze zijn om een driedimensionale (3D) weergave van de neurovasculaire structuur te verkrijgen. Bovendien werd fluorgoud (FG) aangebracht op het gebied rond de middelste hersenvliesslagader (MMA) in de schedel dura mater om de oorsprong van CGRP-immunoreactieve zenuwvezels te bepalen, en getraceerd naar het trigeminus ganglion (TG) en cervicale (C) dorsale wortel ganglia (DRG’s), terwijl de FG-gelabelde neuronen verder werden onderzocht samen met CGRP met behulp van immunofluorescentie.
Het doel van deze studie was om een effectief hulpmiddel te bieden voor het onderzoeken van de neurovasculaire structuur in de craniale dura mater voor de CGRP-immunoreactieve innervatie en de oorsprong ervan. Door gebruik te maken van de transparante whole-mount dura mater en de combinatie van de immunofluorescentie, retrograde tracing, confocale technieken en 3D-reconstructie, verwachtten we een nieuw 3D-beeld van de neurovasculaire structuur in de craniale dura mater te presenteren. Deze methodologische benaderingen kunnen verder worden gediend voor het onderzoeken van de pathogenese van verschillende hoofdpijnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie hebben we met succes de distributie en de oorsprong van CGRP-immunoreactieve zenuwvezels in de craniale dura mater aangetoond met behulp van immunofluorescentie, 3D-reconstructie en neurale tracing-benaderingen met CGRP-antilichaam en FG neurale tracer, die de histologische en chemische bewijzen leveren om het auditieve neurovasculaire netwerk beter te begrijpen.
Zoals bekend speelt CGRP een cruciale rol bij de pathogenese van migraine4,<sup cl…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het project van national key R&d program of China (projectcode nr. 2019YFC1709103; nr. 2018YFC1707804) en National Natural Science Foundation of China (projectcode nr. 81774211; nr. 81774432; nr. 81801561).
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
Referenzen
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neurowissenschaften. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint “Taichong” (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neurowissenschaften. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
