Visualisering af Calcitonin Gene-Related Peptid Immunoreactive Innervation af Rat Cranial Dura Mater med immunfluorescens og neural sporing
Summary
Her præsenterer vi en protokol til visualisering af rumlig korrelation af calcitonin genrelateret peptid (CGRP)-immunoreaktive nervefibre og blodkar i kraniedura mater ved hjælp af immunfluorescens og fluorescerende histokemi med henholdsvis CGRP og falloidin. Derudover var oprindelsen af disse nervefibre retrograd spores med en fluorescerende neurale sporstof.
Abstract
Formålet med denne undersøgelse var at undersøge fordelingen og oprindelsen af calcitonin genrelateret peptid (CGRP)-immunoreaktive sensoriske nervefibre af kraniet dura mater ved hjælp af immunfluorescens, tre-dimensionel (3D) genopbygning og retrograd sporing teknik. Her blev nervefibrene og blodkarrene farvet ved hjælp af immunfluorescens og histokemiteknikker med henholdsvis CGRP og fluorescerende falloidin. Den rumlige korrelation mellem dural CGRP-immuoreaktive nervefibre og blodkar blev demonstreret ved 3D-rekonstruktion. I mellemtiden blev oprindelsen af CGRP-immunoreaktive nervefibre opdaget ved neural sporingsteknik med fluorogold (FG) fra området omkring mellempulsåren (MMA) i kraniedura mater til trigeminal ganglion (TG) og cervikal (C) dorsal rod ganglier (DRGs). Desuden blev de kemiske egenskaber ved FG-mærkede neuroner i TG og DRGs også undersøgt sammen med CGRP ved hjælp af dobbelt immunfluorescens. Ved at drage fordel af den gennemsigtige helmonteringsprøve og 3D-rekonstruktion blev det påvist, at CGRP-immunoreaktive nervefibre og falloidinmærkede arterioler løber sammen eller danner et dural neurovaskulært netværk i 3D-visning, mens FG-mærkede neuroner blev fundet i oftalmiske, maxillary, og mandibulære grene af TG, samt C2-3 DRGs ipsilateral til siden af sporstof ansøgning, hvor nogle af FG-mærkede neuroner præsenteret med CGRP-immunoreaktive udtryk. Med disse tilgange demonstrerede vi de fordelingsmæssige egenskaber ved CGRP-immunoreaktive nervefibre omkring blodkarrene i kraniedura mater samt oprindelsen af disse nervefibre fra TG og DRGs. Set ud fra et metodeperspektiv kan det give en værdifuld reference til forståelse af den komplicerede neurovaskulære struktur af kraniedura mater under den fysiologiske eller patologiske tilstand.
Introduction
Den kraniale dura mater er det yderste lag af meninges for at beskytte hjernen og indeholder rigelige blodkar og forskellige former for nervefibre1,2. Mange undersøgelser har vist, at sensibiliseret kraniedura mater kan være den nøglefaktor, der fører til forekomsten af hovedpine, der involverer den unormale vasodilation og innervation3,4,5. Således er kendskabet til neurovaskulær struktur i kraniedura mater vigtig for at forstå patogenese af hovedpine, især for migræne.
Selv om dura innervation tidligere er blevet undersøgt med den konventionelle immunohistochemistry, den rumlige korrelation af nervefibre og blodkar i kraniet dura mater var mindre undersøgt6,7,8,9. For at afsløre den durale neurovaskulære struktur mere detaljeret blev calcitonin genrelateret peptid (CGRP) og falloidin valgt som markører for henholdsvis farvning af duralnervefibre og blodkar i hele monteret kranie dura mater med immunfluorescens og fluorescerende histokemi10. Det kan være et optimalt valg at opnå en tredimensionel (3D) visning af neurovaskulær struktur. Derudover blev fluorogold (FG) anvendt på området omkring midterste meningeal arterie (MMA) i kraniet dura mater at bestemme oprindelsen af CGRP-immunoreaktive nervefibre, og spores til trigeminus ganglion (TG) og livmoderhalskræft (C) dorsal rod ganglier (DRGs), mens FG-mærkede neuroner blev undersøgt yderligere sammen med CGRP ved hjælp af immunofluorescens.
Formålet med denne undersøgelse var at tilvejebringe et effektivt redskab til undersøgelse af den neurovaskulære struktur i kraniedura mater for CGRP-immunoreaktiv innervation og dens oprindelse. Ved at drage fordel af den gennemsigtige helmonteringsdura mater og kombinere immunfluorescens, retrograd sporing, konfokale teknikker og 3D-rekonstruktion forventede vi at præsentere et nyt 3D-billede af den neurovaskulære struktur i kraniedura mater. Disse metodologiske tilgange kan yderligere serveres til at udforske patogenese af forskellige hovedpiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse har vi med succes demonstreret distributionen og oprindelsen af CGRP-immunoreaktive nervefibre i kraniedura mater ved hjælp af immunfluorescens, 3D-rekonstruktion og neurale sporingsmetoder med CGRP-antistof og FG neurale sporstof, hvilket giver de histologiske og kemiske beviser for bedre at forstå det durale neurovaskulære netværk.
Som det var kendt, CGRP spiller en kritisk rolle i patogenese af migræne4,17…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af projektet national key R&d Program of China (Project Code no. 2019YFC1709103; no. 2018YFC1707804) og National Natural Science Foundation of China (Project Code no. 81774211; nr. 81774432; nr. 81801561).
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
Referenzen
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neurowissenschaften. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint “Taichong” (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neurowissenschaften. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
