La Visualización De La Calcitonina Gen-Relacionado Con El Péptido Inmunorreactiva Inervación De La Rata Dura Mater Craneal Con Inmunofluorescencia Y Trazado Neural
Summary
Aquí presentamos un protocolo para visualizar la correlación espacial del péptido gene-relacionado de la calcitonina (CGRP) – fibras de nervio immunoreactive y vasos sanguíneos en el mater craneal del dura usando inmunofluorescencia e histoquímica fluorescente con CGRP y phalloidin, respectivamente. Además, el origen de estas fibras de nervio era retrógrado trazado con un trazador de los nervios fluorescente.
Abstract
El objetivo de este estudio era examinar la distribución y el origen del péptido gene-relacionado de la calcitonina (CGRP) – fibras de nervio sensoriales immunoreactive del mater craneal del dura usando inmunofluorescencia, la reconstrucción tridimensional (3D) y la técnica retrógrada del trazo. Aquí, las fibras de nervio y los vasos sanguíneos fueron manchados usando técnicas de la inmunofluorescencia y de la histoquímica con CGRP y el phalloidin fluorescente, respectivamente. La correlación espacial de las fibras de nervio CGRP-immuoreactive durales y de los vasos sanguíneos fue demostrada por la reconstrucción 3D. Mientras tanto, el origen de las fibras de nervio CGRP-immunoreactive fue detectado por técnica de los nervios que trazaba con el fluorogold (FG) del área alrededor de la arteria meníngea media (MMA) en el mater craneal del dura al ganglio del trigeminal (TG) y a los ganglios cervicales (c) de la raíz dorsal (DRGs). Además, las características químicas de las neuronas FG-etiquetadas en el TG y drgs también fueron examinadas junto con CGRP usando inmunofluorescencias dobles. Aprovechando la muestra transparente de montaje completo y la reconstrucción 3D, se demostró que las fibras nerviosas CGRP-inmunorreactivas y las arteriolas etiquetadas con faloidina corren juntas o formando por separado una red neurovascular dural en una vista 3D, mientras que las neuronas etiquetadas con FG se encontraron en las ramas oftálmicas, maxilares y mandibulares de TG, así como el C2-3 DRGs ipsolateral al lado de la aplicación del trazador en el que algunas de las neuronas etiquetadas con FG presentaron expresión CGRP-inmunorreactiva. Con estos acercamientos, demostramos las características distributionales de las fibras de nervio CGRP-immunoreactive alrededor de los vasos sanguíneos en el mater craneal del dura, así como el origen de estas fibras de nervio del TG y de DRGs. Desde la perspectiva de la metodología, puede proporcionar una referencia valiosa para comprender la complicada estructura neurovascular de la duramadre craneal bajo la condición fisiológica o patológica.
Introduction
La duramadre craneal es la capa más externa de meninges para proteger el cerebro y contiene abundantes vasos sanguíneos y diferentes tipos de fibras nerviosas1,2. Muchos estudios han demostrado que la duramadre craneal sensibilizada puede ser el factor clave que conduce a la aparición de dolores de cabeza, que implican la vasodilatación anormal y la inervación3,4,5. Así, el conocimiento de la estructura neurovascular en el mater craneal del dura es importante para entender la patogenesia de dolores de cabeza, especialmente para la jaqueca.
Aunque la inervación de la duramadre se haya estudiado previamente con la inmunohistoquímica convencional, la correlación espacial de las fibras nerviosas y los vasos sanguíneos en la duramadre craneal fueron menos estudiadas6,7,8,9. Para revelar la estructura neurovascular dural más detalladamente, el péptido gene-relacionado de la calcitonina (CGRP) y el phalloidin fueron seleccionados como los marcadores para la coloración respectivamente de las fibras nerviosas durales y de los vasos sanguíneos en el mater craneal del entero-montaje con inmunofluorescencia e histoquímica fluorescente10. Puede ser una opción óptima para obtener una visión tridimensional (3D) de la estructura neurovascular. Además, el fluorogold (FG) fue aplicado en el área alrededor de la arteria meníngea media (MMA) en el mater craneal del dura para determinar el origen de las fibras de nervio CGRP-immunoreactive, y trazado al ganglio del trigeminal (TG) y a los ganglios cervicales (c) de la raíz dorsal (DRGs), mientras que las neuronas FG-etiquetadas fueron examinadas más a fondo junto con CGRP usando inmunofluorescencia.
El objetivo de este estudio era proporcionar una herramienta eficaz para investigar la estructura neurovascular en el mater craneal del dura para la inervación CGRP-immunoreactive y su origen. Tomando la ventaja del mater transparente del dura del entero-montaje y combinando la inmunofluorescencia, el trazo retrógrado, las técnicas confocales, y la reconstrucción 3D, esperábamos presentar una vista 3D nueva de la estructura neurovascular en el mater craneal del dura. Estos acercamientos metodológicos se pueden servir más a fondo para explorar la patogenesia de diversos dolores de cabeza.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos demostrado con éxito la distribución y el origen de las fibras nerviosas CGRP-inmunorreactivas en la duramadre craneal utilizando inmunofluorescencia, reconstrucción 3D y enfoques de trazado neuronal con anticuerpo CGRP y trazador neural FG, proporcionando las evidencias histológicas y químicas para comprender mejor la red neurovascular dural.
Como era sabido, CGRP desempeña un papel crítico en la patogenesia de lajaqueca 4,<sup …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el proyecto del Programa Nacional de I+D Clave de China (Código de Proyecto nº 2019YFC1709103; nº 2018YFC1707804) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Código de Proyecto nº 81774211; nº 81774432; nº 81801561).
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
Referenzen
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neurowissenschaften. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint “Taichong” (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neurowissenschaften. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
