Hier wordt een fosfaatprotemische benadering gepresenteerd, namelijk stop and go extractietip op basis van phosfoproteom, die een hoge doorvoer en diepe dekking van Arabidopsis phosphoproteome biedt. Deze aanpak definieert het overzicht van osmotische stresssignalering in Arabidopsis.
Eiwitfosforylatie is cruciaal voor de regulatie van enzymactiviteit en genexpressie onder osmotische conditie. Op massaspectrometrie (MS) gebaseerde phosphoproteomics heeft de manier van het bestuderen van plantsignaaltransductie veranderd. De eis van veel uitgangsmaterialen en een langere meettijd van de lidstaten om de diepte van de dekking te bereiken, was echter de beperkende factor voor de studie met een hoge doorvoer van wereldwijde fosfaatprotemische veranderingen in planten. Om de gevoeligheid en doorvoer van plantaardige fosfoproteomics te verbeteren, hebben we een stop and go extractie (stage) tip gebaseerde phosphoproteomics aanpak ontwikkeld in combinatie met Tandem Mass Tag (TMT) etikettering voor de snelle en uitgebreide analyse van plantfosforylatie perturbatie als reactie op osmotische stress. Gebruikmakend van de eenvoud en hoge doorvoer van fasepunttechniek, duurt de hele procedure ongeveer een uur met behulp van twee tips om fosfopeptideverrijking, fractionering en monsterreinigingsstappen af te ronden, wat een gebruiksvriendelijke en hoge efficiëntie van de aanpak suggereert. Deze aanpak biedt niet alleen een diepgaande analyse van de fysfoproteomics (> 11.000 fosfopeptide-identificatie), maar toont ook de superieure scheidingsefficiëntie (< 5% overlap) tussen aangrenzende fracties aan. Verder is multiplexing bereikt met behulp van TMT-etikettering om de fosfaatprotemische veranderingen van wilde en snrk2 decuple mutante planten te kwantificeren. Deze aanpak is met succes gebruikt om de fosforyleringsgebeurtenissen van Raf-achtige kinases te onthullen als reactie op osmotische stress, die licht werpt op het begrip van vroege osmotische signalering in landplanten.
Hoge zoutgehalte, lage temperatuur en droogte veroorzaken osmotische spanningen, wat een belangrijke milieufactor is die de productiviteit van planten beïnvloedt1,2. Eiwitfosforylatie is een van de belangrijkste post-translationele modificaties die signaalperceptie en transductie bemiddelen in de reactie van planten op osmotische stress3,4,5. SNF1-gerelateerde eiwitkinase 2s (SnRK2s) zijn betrokken bij de osmotische stresssignalering6. Negen van de tien leden van de SnRK2-familie vertonen een aanzienlijke activering als reactie op osmotische stress7,8. De snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutant met mutaties in alle tien SnRK2 vertoonde overgevoeligheid voor osmotische stress. In snrk2-dec mutant wordt de osmotische stress-geïnduceerde accumulatie van inositol 1,4,5-trisfosfaat (IP3),abscisinezuur (ABA) biosynthese en genexpressies sterk verminderd, wat de vitale rol van SnRK2s in osmotische stressreactiesbenadrukt 6. Het is echter nog steeds onduidelijk hoe SnRK2s kinases deze biologische processen reguleren. Profilering van de fosfaatprotemische veranderingen als reactie op osmotische stress is een efficiënte manier om deze kloof te overbruggen en de osmotische stress-geactiveerde verdedigingsmechanismen in planten af te baken.
Massaspectrometrie (MS) is een krachtige techniek voor het in kaart brengen van plantfosfaat9. Karakterisering van plantfosfaatproteomics blijft echter een uitdaging vanwege het dynamische bereik van plantenproteoom en de complexiteit van plantlysaat4. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, ontwikkelden we een universele plantfosfoproteomische workflow, die ongewenste interferenties zoals van fotosynthetische pigmenten en secundaire metabolieten elimineert en de diepe dekking van plantfosfaat10mogelijk maakt. Verschillende fosfopeptideverrijkingsmethoden zoals geïmmobiliseerde metaalionaffiniteitschromatografie (IMAC) en metaaloxidechromatografie (MOC) zijn ontwikkeld voor het verrijken van fosfopeptiden voorafgaand aan MS-analyse11,12,13,14,15,16. Zure niet-fosfiumpeptiden co-zuiveren met fosfopeptiden zijn de belangrijkste interferenties voor fosfopeptide detectie. Voorheen hebben we de pH-waarde en organische zuurconcentratie van de IMAC-belastingsbuffer gestandaardiseerd om de binding van niet-fosfopeptiden te elimineren, om meer dan 90% verrijkingsspecificatie te verkrijgen die de prefractiestap11omzeilt.
Monsterverlies in het meerstapsproces van fosfopeptideverrijking en fractionering belemmert de gevoeligheid van de identificatie van fosfopeptiden en de diepte van de fosfaatprotemische dekking. Stop-and-go-extractie tips (fase tips) zijn pipet tips die kleine schijven bevatten om het uiteinde van de punt te doppen, die kunnen worden opgenomen met chromatografie voor peptide fractionering en reiniging17. Monsterverlies tijdens de fasepuntprocedure kan worden geminimaliseerd door monsteroverdracht tussen de buizen te voorkomen. We hebben met succes fasetip geïmplementeerd in Ga3 +– IMAC en Fe3 +– IMAC om laag overvloedige meerdere gefosforyleerde peptiden te scheiden van afzonderlijk gefosforyleerde peptiden, wat de diepte van menselijk fosfoproteom15verbeterde. Bovendien heeft het gebruik van een hoge pH-omgekeerde fase (Hp-RP) fasetip de bredere dekking van het proteoom van het menselijk membraan aangetoond in vergelijking met die van sterke kationenuitwisseling (SCX) en sterke anionenuitwisseling (SAX) chromatografie18. Daarom kan de integratie van IMAC- en Hp-RP-trapstiptechnieken de dekking van plantfosfoproteom verhogen met eenvoud, hoge specificiteit en hoge doorvoer. We hebben aangetoond dat deze strategie meer dan 20.000 fosforyleringslocaties van Arabidopsis-zaailingen identificeerde, wat een verbeterde diepte van plantfosfaat19vertegenwoordigt.
Hier rapporteren we een op tips gebaseerd fosfaatprotemofoonprotocol voor fosfaatprotemische profilering in Arabidopsis. Deze workflow werd toegepast om de fosfaatprotemische verstoring van wilde-type en snrk2-dec mutant zaailingen te bestuderen als reactie op osmotische stress. De fosfaatprotemische analyse onthulde de fosforyleringslocaties die betrokken zijn bij kinaseactivering en vroege osmotische stresssignalering. Vergelijkende analyse van wild-type en snrk2-dec mutante fosfaatgegevens leidde tot de ontdekking van een Raf-achtige kinase (RAF)-SnRK2 kinase cascade die een sleutelrol speelt in osmore stresssignalering in hoge planten.
Het dynamisch bereik en de complexiteit van plantproteoom en fosfaatproteom zijn nog steeds een beperkende factor tot diepte van fosfaatproteomics analyses. Ondanks het vermogen van single run LC-MS/MS-analyse om 10.000 fosforyleringslocaties21,22te identificeren, is de dekking van het hele fosfaat van de installatie nog steeds beperkt. Daarom is een fosfaatprotemische workflow vereist die een hoge gevoeligheid en superieure scheidingsefficiëntie biedt bij het p…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Strategic Priority Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen, Grant XDB27040106.
1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |