Un modèle de culture cellulaire pour la production de stocks élevés de virus de l’hépatite E de Titer

L’hépatite E est une maladie assez sous-estimée avec une prévalence croissante dans le monde entier. Environ 20 millions d’infections entraînent plus de 70 000 décès par an¹. L’agent sous-jacent, le virus de l’hépatite E (HEV), a été réaffecté récemment et est maintenant classé dans la famille hepeviridae, y compris les genres Orthohepevirus et Piscihepevirus. HEV de diverses origines sont classés dans l’espèce Orthohèpevirus A-D y compris les isolats de l’homme, porc, lapins, rats, oiseaux et autres mammifères². À l’heure actuelle, huit génotypes différents (GT) du virus de l’ARN à brin unique orienté vers un positif ont été identifiés². Bien qu’ils diffèrent dans leur identité de séquence, les voies de transmission et la répartition géographique, leur structure génomique est fortement conservée. Plus spécifique, le génome hev de 7,2 kbp est divisé en 3 cadres de lecture ouverts majeurs (ORF1-3). Alors que ORF1 code toutes les enzymes nécessaires à une réplication réussie dans la cellule hôte, ORF2 code la protéine capside, et la protéine ORF3 fonctionne comme un canal d’ion fonctionnel requis pour l’assemblage et la libération des particules infectieuses³. Une fois libéré dans le lumen basal ou apical, le VHEM existe chez les deux espèces, quasi-enveloppées et non enveloppées/nues selon que le virus provient du sang ou des excréments, respectivement^4,5.

Alors que gt1 et GT2 se trouvent principalement dans les pays en développement uniquement infecter les humains⁶ par la voie fécale-orale, GT3, GT4 et GT7 se produisent principalement dans les pays développés^1,7 avec une variété d’espèces servant de réservoirs, par exemple, porcs⁸, rat⁹, poulet^10,11, cerf¹², mangouste¹³, chauve-souris¹⁴, lapin^15,16, sanglier¹⁷ et beaucoup plus^7,18,19, fournissant des preuves de zoonose^7,20,21,22. En plus des conditions sanitaires inadéquates²³ et des produits alimentaires contaminés^12,24,25,26, la transmission par transfusion sanguine et transplantations d’organes est également possible^27,28. Le VHEV est une cause fréquente de cirrhose du foie et d’insuffisance hépatique^29, en particulier chez les patients atteints d’une maladie hépatique préexistante, d’immunocompromis (génotype 3, 4 et 7) et de femmes enceintes (génotype 1). A noter, il ya aussi des manifestations extrahépatiques telles que la maladie hématopoïétique^30,31,32, troubles neurologiques³³ et les lésions rénales³⁴.

À ce jour, la ribavirine (RBV) médicament hors étiquette est le traitement de choix pour de nombreux patients infectés^35,36. Cependant, des cas d’échec de traitement et de mauvais résultats cliniques à long terme ont été rapportés. L’échec de traitement a été lié à la mutagénèse virale et à l’hétérogénéité virale accrue dans les patients chroniquement infectés^37,38,39. Au contraire, une étude multicentrique rétrospective européenne récente n’a pas été en mesure de corréler les mutations de la polymérase à l’échec du traitement rbv⁴⁰. Dans les observations cliniques et les expériences in vitro, l’interféron^41,42,43, sofosbuvir^44,45, sels de zinc⁴⁶ et silvestrol^47,48 ont également montré des effets antiviraux. Néanmoins, un traitement spécifique de VH reste à trouver, entravé par le manque de connaissances au sujet du cycle de vie de HEV et de sa pathogénie. Par conséquent, un système robuste de culture cellulaire pour les études virologiques et le développement de nouveaux médicaments antiviraux est nécessaire de toute urgence⁴⁹.

Malheureusement, comme d’autres virus de l’hépatite, le VHE est difficile à propager dans les lignées cellulaires conventionnelles et progresse généralement très lentement, ce qui entraîne de faibles charges virales. Néanmoins, certains groupes ont été en mesure d’augmenter les charges virales par la génération de sous-clones ligne cellulaire⁵⁰ ou l’ajustement des suppléments de médias⁵¹. Récemment, la génération de clones d’ADNC⁵² et l’adaptation des isolats du patient primaire en passant^53,54 encore amélioré propagation HEV dans la culture cellulaire⁵⁵. Dans ce protocole, nous avons utilisé le génome d’une souche Kernow-C1 adaptée à la culture cellulaire (appelée p6_WT)⁵⁴ et d’une souche mutante abritant une mutation améliorant la réplication (appelée p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 est la souche la plus fréquemment utilisée dans la culture cellulaire HEV et est capable de produire des charges virales élevées. En évaluant les numéros de copie virale de l’ARN, la réplication du VH peut être surveillée in vitro. Néanmoins, ces techniques ne permettent pas d’évaluer le nombre de particules infectieuses produites. Par conséquent, nous avons établi une coloration d’immunofluorescence pour déterminer les unités de formation de mise au point (FFU/mL).

La méthode⁵⁶ décrite ici peut être utilisée pour produire des particules virales infectieuses pleine longueur qui sont capables d’infecter une variété de types de cellules d’origines diverses, y compris les cellules primaires et les lignées cellulaires des mammifères. Il s’agit d’une condition préalable fondamentale pour déchiffrer les aspects importants de l’infection et du tropisme de HEV. Il n’y a pas besoin d’inoculation avec des isolats de patient habituellement limités. La production de particules infectieuses de HEV à partir de plasmides pose une source infinie, ce qui rend ce protocole comparablement efficace. En outre, ce système peut être utilisé pour la génétique inverse permettant l’étude de l’altération du génome in vivo identifié et leur impact sur la réplication et la condition physique du VH. Cette technique surmonte de nombreuses limitations et peut suivre la voie pour le développement de médicaments, les études de mutagenesis et l’évaluation des interactions virus-hôte tels que la restriction ou les facteurs d’entrée.