Summary

Un modèle de culture cellulaire pour la production de stocks élevés de virus de l’hépatite E de Titer

Published: June 26, 2020
doi:

Summary

Décrit ici est une méthode efficace sur la façon de produire des stocks de trier virale élevé du virus de l’hépatite E (HEV) pour infecter efficacement les cellules hépatomes. Avec la méthode présentée, les particules virales non enveloppées et les particules virales enveloppées peuvent être récoltées et utilisées pour inoculer diverses lignées cellulaires.

Abstract

Le virus de l’hépatite E est la principale cause de cirrhose du foie et d’insuffisance hépatique avec une prévalence croissante dans le monde entier. Le virus de l’ARN à brin unique est principalement transmis par transfusion sanguine, des conditions sanitaires inadéquates et des produits alimentaires contaminés. À ce jour, la ribavirine (RBV) est le traitement de choix pour de nombreux patients. Néanmoins, un traitement spécifique de VHEM reste à identifier. Jusqu’à présent, les connaissances sur le cycle de vie et la pathogénie du VH ont été sérieusement entravées en raison de l’absence d’un système efficace de culture cellulaire HEV. Un système de culture cellulaire robuste est essentiel pour l’étude du cycle de vie viral qui comprend également la pathogénie virale. Avec la méthode décrite ici, on peut produire des titres viraux allant jusqu’à 3 x 106 unité de formation de mise au point /mL (FFU/mL) de HEV non enveloppé et jusqu’à 5 x 104 FFU/mL de HEV enveloppé. En utilisant ces particules, il est possible d’infecter une variété de cellules d’origines diverses, y compris les cellules primaires et humaines, ainsi que les lignées cellulaires animales. La production de particules infectieuses de HEV à partir de plasmides pose une source infinie, ce qui rend ce protocole extrêmement efficace.

Introduction

L’hépatite E est une maladie assez sous-estimée avec une prévalence croissante dans le monde entier. Environ 20 millions d’infections entraînent plus de 70 000 décès par an1. L’agent sous-jacent, le virus de l’hépatite E (HEV), a été réaffecté récemment et est maintenant classé dans la famille hepeviridae, y compris les genres Orthohepevirus et Piscihepevirus. HEV de diverses origines sont classés dans l’espèce Orthohèpevirus A-D y compris les isolats de l’homme, porc, lapins, rats, oiseaux et autres mammifères2. À l’heure actuelle, huit génotypes différents (GT) du virus de l’ARN à brin unique orienté vers un positif ont été identifiés2. Bien qu’ils diffèrent dans leur identité de séquence, les voies de transmission et la répartition géographique, leur structure génomique est fortement conservée. Plus spécifique, le génome hev de 7,2 kbp est divisé en 3 cadres de lecture ouverts majeurs (ORF1-3). Alors que ORF1 code toutes les enzymes nécessaires à une réplication réussie dans la cellule hôte, ORF2 code la protéine capside, et la protéine ORF3 fonctionne comme un canal d’ion fonctionnel requis pour l’assemblage et la libération des particules infectieuses3. Une fois libéré dans le lumen basal ou apical, le VHEM existe chez les deux espèces, quasi-enveloppées et non enveloppées/nues selon que le virus provient du sang ou des excréments, respectivement4,5.

Alors que gt1 et GT2 se trouvent principalement dans les pays en développement uniquement infecter les humains6 par la voie fécale-orale, GT3, GT4 et GT7 se produisent principalement dans les pays développés1,7 avec une variété d’espèces servant de réservoirs, par exemple, porcs8, rat9, poulet10,11, cerf12, mangouste13, chauve-souris14, lapin15,16, sanglier17 et beaucoup plus7,18,19, fournissant des preuves de zoonose7,20,21,22. En plus des conditions sanitaires inadéquates23 et des produits alimentaires contaminés12,24,25,26, la transmission par transfusion sanguine et transplantations d’organes est également possible27,28. Le VHEV est une cause fréquente de cirrhose du foie et d’insuffisance hépatique29, en particulier chez les patients atteints d’une maladie hépatique préexistante, d’immunocompromis (génotype 3, 4 et 7) et de femmes enceintes (génotype 1). A noter, il ya aussi des manifestations extrahépatiques telles que la maladie hématopoïétique30,31,32, troubles neurologiques33 et les lésions rénales34.

À ce jour, la ribavirine (RBV) médicament hors étiquette est le traitement de choix pour de nombreux patients infectés35,36. Cependant, des cas d’échec de traitement et de mauvais résultats cliniques à long terme ont été rapportés. L’échec de traitement a été lié à la mutagénèse virale et à l’hétérogénéité virale accrue dans les patients chroniquement infectés37,38,39. Au contraire, une étude multicentrique rétrospective européenne récente n’a pas été en mesure de corréler les mutations de la polymérase à l’échec du traitement rbv40. Dans les observations cliniques et les expériences in vitro, l’interféron41,42,43, sofosbuvir44,45, sels de zinc46 et silvestrol47,48 ont également montré des effets antiviraux. Néanmoins, un traitement spécifique de VH reste à trouver, entravé par le manque de connaissances au sujet du cycle de vie de HEV et de sa pathogénie. Par conséquent, un système robuste de culture cellulaire pour les études virologiques et le développement de nouveaux médicaments antiviraux est nécessaire de toute urgence49.

Malheureusement, comme d’autres virus de l’hépatite, le VHE est difficile à propager dans les lignées cellulaires conventionnelles et progresse généralement très lentement, ce qui entraîne de faibles charges virales. Néanmoins, certains groupes ont été en mesure d’augmenter les charges virales par la génération de sous-clones ligne cellulaire50 ou l’ajustement des suppléments de médias51. Récemment, la génération de clones d’ADNC52 et l’adaptation des isolats du patient primaire en passant53,54 encore amélioré propagation HEV dans la culture cellulaire55. Dans ce protocole, nous avons utilisé le génome d’une souche Kernow-C1 adaptée à la culture cellulaire (appelée p6_WT)54 et d’une souche mutante abritant une mutation améliorant la réplication (appelée p6_G1634R)37. Kernow-C1 est la souche la plus fréquemment utilisée dans la culture cellulaire HEV et est capable de produire des charges virales élevées. En évaluant les numéros de copie virale de l’ARN, la réplication du VH peut être surveillée in vitro. Néanmoins, ces techniques ne permettent pas d’évaluer le nombre de particules infectieuses produites. Par conséquent, nous avons établi une coloration d’immunofluorescence pour déterminer les unités de formation de mise au point (FFU/mL).

La méthode56 décrite ici peut être utilisée pour produire des particules virales infectieuses pleine longueur qui sont capables d’infecter une variété de types de cellules d’origines diverses, y compris les cellules primaires et les lignées cellulaires des mammifères. Il s’agit d’une condition préalable fondamentale pour déchiffrer les aspects importants de l’infection et du tropisme de HEV. Il n’y a pas besoin d’inoculation avec des isolats de patient habituellement limités. La production de particules infectieuses de HEV à partir de plasmides pose une source infinie, ce qui rend ce protocole comparablement efficace. En outre, ce système peut être utilisé pour la génétique inverse permettant l’étude de l’altération du génome in vivo identifié et leur impact sur la réplication et la condition physique du VH. Cette technique surmonte de nombreuses limitations et peut suivre la voie pour le développement de médicaments, les études de mutagenesis et l’évaluation des interactions virus-hôte tels que la restriction ou les facteurs d’entrée.

Protocol

REMARQUE : Toutes les expériences sont effectuées sous condition BSL-2. Tous les matériaux qui entrent en contact avec l’ARN du virus de l’hépatite E ou le virus infectieux doivent être rincés correctement avec 4% Kohrsolin FF à partir d’un conteneur de déchets à l’intérieur du capot avant l’élimination. 1. Préparation plasmide Inoculer un milieu de 200 mL LB contenant une ampicilline de 100 μg/mL avec une apéricile Escherichia coli JM109 transformée…

Representative Results

Dans ce protocole, nous décrivons la production de HEVcc infectieux à haute teneur en titer. La première étape consiste à isoler l’ADN plasmide (pBluescript_SK_HEVp654 et pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figure 8a), qui est ensuite linéaire par digestion de restriction et purifié pour la transcription in vitro (Figure 1). Une linéarisation réussie peut être vérifiée en comparant l’ADN plasmide non dig…

Discussion

En commençant par la préparation du plasmide, les rendements de l’ADN devraient dépasser 150 ng/μL pour être en mesure d’effectuer une linéarisation multiple à partir du même stock de plasmide, ce qui minimise le risque de mutagenèse induite par les bactéries des séquences génomiques cruciales. En outre, il est important de vérifier la digestion de restriction pour la linéarisation complète du plasmide par électrophorèse de gel (figure 8b). Un manque d’ADN plasmide lin…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à Suzanne Emerson pour le virus de l’hépatite E p6 clone. Rainer Ulrich, Institut Friedrich Loeffler, Allemagne, a fourni un sérum hyperimmune de lapin spécifique à HEV. En outre, nous remercions tous les membres du Département de Virologie Moléculaire et Médicale de l’Université de la Ruhr Bochum pour leur soutien et leur discussion. Les chiffres 1 à 7 ont été générés avec BioRender.com.

Materials

0.45 µm mesh Sarstedt 83.1826 Harvest extracellular Virus
4 % Histofix CarlRoth P087.4 Immunofluorescence
Acetic acid CarlRoth 6755.1 Collagen working solution
Amicon Ultra-15 Merck Millipore UFC910024 Virus harvesting
Ampicillin Sigma-Aldrich A1593 Selection of transformed bacteria
ATP Roche 11140965001 in vitro transcription and electroporation
BioRender BioRender Figure Generation
CaCl2 Roth 5239.2 Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile Serva 47256.01 Collagen working solution
CTP Roche 11140922001 in vitro transcription
Cuvette Biorad 165-2088 Electroporation
DAPI Invitrogen D21490 Immunofluorescence
DMEM gibco 41965-039 Cell culture
DNAse Promega M6101 in vitro transcription
DTT Promega included in P2077 in vitro transcription
EGTA Roth 3054.3 Cytomix
Escherichia coli JM109 Promega L2005 Transformation
Fetal bovine serum gibco 10270106 Cell culture
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01 Immunofluorescence
GenePulser Xcell Electroporation System BioRad 1652660 Electroporation
Gentamycin gibco 15710049 Cell culture
GTP Roche 11140957001 in vitro transcription
H2O Braun 184238001 Immunofluorescence
Hepes Invitrogen 15630-03 Cytomix
Horse serum gibco 16050122 Immunofluorescence
K2HPO4 Roth P749.1 Cytomix
KCL Roth 6781.3 Cytomix
KH2PO4 Roth 3904.2 Cytomix
L-Glutamin gibco 25030081 Cell culture
L-Glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251-5G Cytomix
MEM gibco 31095-029 Cell culture
MEM NEAA (100×) gibco 11140-035 Cell culture
MgCl2 Roth 2189.2 Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One Thermo Fisher ND-ONE-W DNA/RNA concentration
MluI enzyme NEB R0198L Linearization
NEB buffer NEB included in R0198L Linearization
NucleoSpin Plasmid kit Macherey & Nagel 740588.250 Plasmid preparation
NucleoSpin RNA Clean-up Kit Macherey & Nagel 740948.250 RNA purification
PBS gibco 70011051 Cell culture
Pen/Strep Thermo Fisher 15140122 Cell culture
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) Todt et.al Virus production
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) Shukla et al. GenBank accession no. JQ679013 Virus production
Primary antibody 1E6 LS-Bio C67675 Immunofluorescence
Primary antibody 8282 Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 DNA extraction
Ribo m7G Cap Analog Promega P1711 in vitro transcription
RNase away CarlRoth A998.3 RNA purification
RNasin (RNase inhibitor) Promega N2515 in vitro transcription
Secondary antibody donkey anti-mouse 488 Thermo Fisher A-21202 Immunofluorescence
Secondary antibody goat anti-rabbit 488 Thermo Fisher A-11008 Immunofluorescence
Sodium Pyruvat gibco 11360070 Cell culture
T7 RNA polymerase Promega P2077 in vitro transcription
Transcription Buffer Promega included in P2077 in vitro transcription
Triton X-100 CarlRoth 3051.3 Immunofluorescence
Trypsin-EDTA (0.5 %) gibco 15400054 Cell culture
ultra-low IgG gibco 1921005PJ Cell culture
UTP Roche 11140949001 in vitro transcription

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Meister, T. L., Klöhn, M., Steinmann, E., Todt, D. A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks. J. Vis. Exp. (160), e61373, doi:10.3791/61373 (2020).

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