उच्च टाइटर हेपेटाइटिस ई वायरस स्टॉक्स के उत्पादन के लिए एक सेल संस्कृति मॉडल
Summary
यहां वर्णित कैसे हेपेटाइटिस ई वायरस (HEV) के उच्च वायरल टाइटर स्टॉक का उत्पादन करने के लिए कुशलतापूर्वक हेपेटोमा कोशिकाओं को संक्रमित करने पर एक प्रभावी तरीका है । प्रस्तुत विधि के साथ, दोनों गैर-छा, साथ ही छा वायरल कणों को काटा जा सकता है और विभिन्न कोशिका रेखाओं को फिर से प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Abstract
हेपेटाइटिस ई वायरस दुनिया भर में बढ़ती व्यापकता के साथ जिगर सिरोसिस और जिगर की विफलता का प्रमुख कारण है । एकल फंसे आरएनए वायरस मुख्य रूप से रक्त चढ़ाने, अपर्याप्त स्वच्छता की स्थिति और दूषित खाद्य उत्पादों से फैलता है । ऑफ लेबल दवा रिबेनाविरिन (आरबीवी) को डेट करने के लिए कई रोगियों के लिए पसंद का इलाज है। फिर भी, एक विशिष्ट HEV उपचार की पहचान की जानी बाकी है । अब तक, एचईवी जीवन चक्र और रोगजनन के बारे में ज्ञान एक कुशल एचईवी सेल संस्कृति प्रणाली की कमी के कारण गंभीर रूप से बाधित हुआ है। वायरल जीवन चक्र के अध्ययन के लिए एक मजबूत सेल कल्चर सिस्टम जरूरी है जिसमें वायरल रोगजनक भी शामिल है । यहां वर्णित विधि के साथ एक गैर-छा एचईवी की 3 x 106 फोकस बनाने इकाई/एमएल (FFU/mL) और 5 x 104 FFU/mL तक छा HEV के वायरल टाइटर्स का उत्पादन कर सकते हैं । इन कणों का उपयोग करके, प्राथमिक कोशिकाओं और मानव, साथ ही पशु कोशिका लाइनों सहित विविध मूल की विभिन्न कोशिकाओं को संक्रमित करना संभव है। प्लाज्मिड्स से संक्रामक एचईवी कणों का उत्पादन एक अनंत स्रोत बन गया है, जो इस प्रोटोकॉल को बेहद कुशल बनाता है।
Introduction
हेपेटाइटिस ई दुनिया भर में बढ़ती व्यापकता के साथ एक काफी कम करके आंका रोग है । लगभग 20 मिलियन संक्रमणों के परिणामस्वरूप प्रति वर्ष 70,000 से अधिक मौतेंहोतीहैं । अंतर्निहित एजेंट, हेपेटाइटिस ई वायरस (HEV), हाल ही में फिर से असाइन किया गया था और अब जेनेरा ऑर्थोहेपेवायरस और पिसिहेपेवायरस सहित परिवार Hepeviridae के भीतर वर्गीकृत किया गया है । विभिन्न मूल के एचईवी को ऑर्थोहेपेवायरस ए-डी प्रजातियों के भीतर वर्गेड किया जाता है जिसमें मनुष्यों, सूअर, खरगोशों, चूहों, पक्षियों और अन्य स्तनधारियों2से आइसोलेट्स शामिल हैं। वर्तमान में, सकारात्मक केंद्रित, एकल फंसे आरएनए वायरस के आठ विभिन्न जीनोटाइप (जीटी) की पहचान की गई है। यद्यपि वे अपनी अनुक्रम पहचान, पारेषण और भौगोलिक वितरण के मार्गों में भिन्न होते हैं, लेकिन उनकी जीनोमिक संरचना अत्यधिक संरक्षित होती है। अधिक विशिष्ट, 7.2 केबीपी एचईवी जीनोम को 3 प्रमुख ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ 1-3) में विभाजित किया गया है। जबकि ORF1 मेजबान सेल के भीतर एक सफल प्रतिकृति के लिए आवश्यक सभी एंजाइमों को एन्कोड करता है, ओआरएफ 2 कैप्सिड प्रोटीन को एन्कोड करता है, और ओआरएफ 3 प्रोटीन असेंबली और संक्रामक कणों की रिहाई के लिए आवश्यक एक कार्यात्मक आयन चैनल के रूप में संचालित होता है3। एक बार बेसल या एपिकल ल्यूमेन हेव में छोड़े जाने के बाद, क्रमशः4,,5,5 के आधार पर वायरस रक्त या मल से उत्पन्न होता है या नहीं, दोनों में क्वासिएलोप्ड और गैर-छा/नग्न प्रजातियां मौजूद हैं।
जबकि GT1 और GT2 मुख्य रूप से विकासशील देशों में पाए जाते हैं केवल मल-मौखिक मार्ग के माध्यम से मनुष्यों को संक्रमित6, GT3, GT4 और GT7 मुख्य रूप से विकसित देशों में होते हैं1,,7 जलाशयों के रूप में सेवारत प्रजातियों की एक किस्म के साथ, उदाहरण के लिए, सूअर8,चूहा9,चिकन10,,11,हिरण12,नेवला13,बल्ले14,खरगोश15,,16,जंगली सूअर17 और कई और अधिक7, 18,,,19,ज़ूनोसिस7,20,18,,21,,22के सबूत प्रदान करते हैं । अपर्याप्त स्वच्छता स्थितियों के अलावा23 और दूषित खाद्य उत्पाद12,24,25,26, रक्ताधान और अंग प्रत्यारोपण के माध्यम से संचरण भी संभव है27,28.26 HEV जिगर सिरोसिस और जिगर की विफलता का एक आम कारण है29 विशेष रूप से पहले से मौजूद जिगर की बीमारी के साथ रोगियों में, इम्यूनोसमझे व्यक्तियों (जीनोटाइप 3, 4 और 7) और गर्भवती महिलाओं (जीनोटाइप 1) । ध्यान दें, हेमेटोपोइटिक रोग30 , 31,,32,,न्यूरोलॉजिकल विकार33और गुर्दे की चोट34 जैसे बाहरी अभिव्यक्तियां भी हैं।34
आज तक, ऑफ-लेबल दवा रिबाविरिन (आरबीवी) कई संक्रमित रोगियों35, 36,36के लिए पसंद का उपचार है। हालांकि, उपचार विफलता और खराब नैदानिक दीर्घकालिक परिणामों के मामलों की सूचना दी गई है । उपचार की विफलता को वायरल म्यूटेनेसिस से जोड़ा गया है और लंबे समय से संक्रमित रोगियों में वायरल विषमता में वृद्धि हुई है37,38,,39. इसके विपरीत, हाल ही में एक यूरोपीय पूर्वव्यापी मल्टीसेंटर अध्ययन आरबीवी उपचार विफलता40के लिए पॉलीमरेज म्यूटेशन को सहसंबंधित करने में सक्षम नहीं था। नैदानिक टिप्पणियों और इन विट्रो प्रयोगों में इंटरफेरॉन41,42, 43,,43सोफोस्बुविर44,,45,जिंक साल्ट46 और सिल्वेस्ट्रोल47,,48 ने भी एंटीवायरल प्रभाव दिखाया है।, बहरहाल, एक विशिष्ट HEV उपचार के लिए पाया जा रहा है, HEV जीवन चक्र और उसके रोगजनन के बारे में ज्ञान की कमी से बाधित । इसलिए, वायरलॉजिकल अध्ययनों के लिए एक मजबूत सेल कल्चर सिस्टम और नई एंटीवायरल दवाओं के विकास की तत्काल आवश्यकताहै।
दुर्भाग्य से, अन्य हेपेटाइटिस वायरस की तरह, एचईवी पारंपरिक सेल लाइनों में प्रचारित करना मुश्किल है और आमतौर पर बहुत धीरे-धीरे कम वायरल लोड की ओर बढ़ता है। फिर भी, कुछ समूह सेल लाइन उपकक्षों की पीढ़ी50 या मीडिया की खुराक51के समायोजन द्वारा वायरल भार को बढ़ावा देने में सक्षम थे। हाल ही में सीडीएनए क्लोन52 का उत्पादन और प्राथमिक रोगी का अनुकूलन 53,54को और बेहतर करके कोशिका संस्कृति55में एचईवी प्रचार में सुधार हुआ।54 इस प्रोटोकॉल में, हमने केर्नो-सी1 तनाव (जिसे p6_WT के रूप में संदर्भित किया जाता है)54 और एक उत्परिवर्ती तनाव को एक प्रतिकृति बढ़ाने वाले उत्परिवर्तन (जिसे p6_G1634R के रूप में संदर्भित)37के जीनोम का उपयोग किया। Kernow-C1 HEV सेल संस्कृति में सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया तनाव है और उच्च वायरल भार का उत्पादन करने में सक्षम है । वायरल आरएनए कॉपी नंबरों का आकलन करके, एचईवी प्रतिकृति विट्रो में निगरानी की जा सकती है। इसके बावजूद ये तकनीकें पैदा किए जा रहे संक्रामक कणों की संख्या के आकलन की अनुमति नहीं देतीं । इसलिए, हमने फोकस फॉर्मिंग यूनिट्स (एफएफयू/एमएल) निर्धारित करने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला स्थापित किया है।
यहां वर्णित विधि५६ पूर्ण लंबाई संक्रामक वायरल कणों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो प्राथमिक कोशिकाओं और स्तनधारी कोशिका लाइनों सहित विविध मूल से विभिन्न प्रकार के कोशिका प्रकारों को संक्रमित करने में सक्षम हैं । यह एचईवी संक्रमण और ट्रोपिज्म के महत्वपूर्ण पहलुओं को समझने के लिए एक मौलिक शर्त है। आमतौर पर सीमित रोगी आइसोलेशन के साथ टीका लगाने की कोई आवश्यकता नहीं है। प्लाज्मिड्स से संक्रामक एचईवी कणों का उत्पादन एक अनंत स्रोत बन गया है, जो इस प्रोटोकॉल को तुलनात्मक रूप से कुशल बनाता है। इसके अलावा, इस प्रणाली रिवर्स आनुवंशिकी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वीवो में की पहचान जीनोम परिवर्तन और HEV प्रतिकृति और फिटनेस पर उनके प्रभाव के अध्ययन को सक्षम करने । यह तकनीक कई सीमाओं पर काबू पा रही है और, दवा विकास, म्यूटेनेसिस अध्ययन और प्रतिबंध या प्रवेश कारकों जैसे वायरस-मेजबान इंटरैक्शन के मूल्यांकन के लिए रास्ता तय कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्लाज्मिड तैयारी के साथ शुरू, डीएनए पैदावार १५० एनजी/μL से अधिक होना चाहिए एक ही प्लाज्मिड स्टॉक से कई रैखिकीकरण करने में सक्षम होना चाहिए, जो महत्वपूर्ण जीनोम दृश्यों के बैक्टीरिया प्रेरित म्यूटाजेन?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हेपेटाइटिस ई वायरस p6 क्लोन के लिए सुजान इमर्सन के आभारी हैं। हेव-विशिष्ट खरगोश हाइपरइम्यून सीरम को रेनर उल्रिच, फ्रेडरिक लोफलर इंस्टीट्यूट, जर्मनी द्वारा कृपया प्रदान किया गया था। इसके अलावा, हम रूर विश्वविद्यालय बोचम में आणविक और चिकित्सा विषाणु विज्ञान विभाग के सभी सदस्यों को उनके समर्थन और चर्चा के लिए धन्यवाद देते हैं । आंकड़े 1-7 BioRender.com के साथ उत्पन्न किए गए थे।
Materials
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
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