Induzione di lesioni cerebrali assonali diffuse nei ratti in base all'accelerazione rotazionale
Summary
Questo protocollo convalida un modello di roditore affidabile, facile da eseguire e riproducibile di lesioni assonali diffuse dal cervello (DAI) che induce danni diffusi alla materia bianca senza fratture o contusioni al cranio.
Abstract
La lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di morte e disabilità. Lesioni assonali diffuse (DAI) è il meccanismo predominante di lesioni in una grande percentuale di pazienti TBI che necessitano di ricovero in ospedale. IL DAI comporta un diffuso danno assonale dovuto a uno scuotimento, una rotazione o lesioni da scoppio, che porta a una rapida lesione assonale e a cambiamenti assonali secondari associati a un impatto duraturo sul recupero funzionale. Storicamente, i modelli sperimentali di DAI senza lesioni focali sono stati difficili da progettare. Qui convalidiamo un modello di roditore semplice, riproducibile e affidabile di DAI che causa danni diffusi alla materia bianca senza fratture o contusioni al cranio.
Introduction
Lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di morte e disabilità negli Stati Uniti. I TBI contribuiscono a circa il 30% di tutti i decessi correlati alle lesioni1,2. Le principali cause di TBI differiscono tra le fasce di età e includono cadute, collisioni ad alta velocità durante lo sport, autolesionismo intenzionale, incidenti automobilistici e assalti1,2,3.
La lesione assonale diffusa del cervello (DAI) è un tipo specifico di TBI indotto dall’accelerazione rotazionale, scuotendo o lesione di scoppio del cervello risultante dal movimento senza restrizioni della testa nell’istante dopo la lesione4,5,6,7,8. DAI comporta un diffuso danno assonale che porta a un danno neurologico di lunga durata associato a scarsi esiti, costi sanitari gravosi e un tasso di mortalità del 33-64%1,2,4,5,9,10,11. Nonostante una recente ricerca significativa sulla patogenesi del DAI, non c’è stato un consenso sulle migliori opzioni di trattamento11,12,13,14.
Negli ultimi decenni, numerosi modelli sperimentali hanno tentato di replicare con precisione diversi aspetti di DAI11,12,15,16. Tuttavia, questi modelli hanno limitazioni data la presentazione unica di DAI rispetto ad altre lesioni focali. Questi modelli precedenti non solo causano lesioni assonali nelle regioni della materia bianca, ma provocano anche lesioni cerebrali focali. Clinicamente, DAI è accompagnato da micro emorragie, che possono costituire una grande causa di danni alla materia bianca.
Solo due modelli animali hanno dimostrato di replicare le caratteristiche cliniche chiave del DAI. Gennarelli e colleghi hanno prodotto il primo dispositivo di rotazione della testa laterale nel 1982, utilizzando l’accelerazione rotazionale della testa senza impatto per indurre il coma con DAI in un primate non umano modello15. Questo modello di primate utilizzava una singola rotazione controllata per l’accelerazione e la decelerazione per passare la testa a 60 gradi entro 10-20 ms. Questa tecnica è stata in grado di emulare la coscienza compromessa e danni assonali diffusi che assomigliavano agli effetti di una grave TBI osservata nei cervelli umani. Tuttavia, i modelli di primati sono molto costosi4,11,16. Basato in parte sul modello precedente, un modello suinato di lesione cerebrale a accelerazione rotazionale è stato progettato nel 1994 (Ross et al.) con risultati simili14.
Questi due modelli animali, anche se hanno prodotto diverse presentazioni di patologia tipica, hanno aggiunto notevolmente ai concetti di patogenesi DAI. La rotazione rapida della testa è generalmente accettata come il metodo migliore per indurre DAI, e i roditori forniscono un modello meno costoso per gli studi di rotazione rapida della testa11,16. Qui, convalidiamo un modello di roditore semplice, riproducibile e affidabile di DAI che causa danni diffusi alla materia bianca senza fratture del cranio o contusioni. Questo modello attuale consentirà una migliore comprensione della fisiopatologia del DAI e lo sviluppo di trattamenti più efficaci.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un modello di roditore di DAI. In DAI, l’accelerazione rotazionale sul cervello provoca un effetto di taglio che innesca cambiamenti assonali e biochimici che portano alla perdita della funzione assonale in un processo progressivo. I cambiamenti assonali secondari sono prodotti da una rapida lesione assonale e sono variabili nella loro estensione e gravità4,5,10. Entro ore o giorni dopo la lesione pri…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine il Dr. Nathan Kleeorin (Dipartimento di Ingegneria Meccanica, Ben-Gurion University del Negev) per il suo aiuto con le misurazioni biomeccaniche. Inoltre, ringraziamo la professoressa Olena Severynovska, Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko e Evgenia Goncharyk del Dipartimento di Fisiologia, Facoltà di Biologia, Ecologia e Medicina, Oles Honchar Dnipro University, Dproni, Ucraina per il suo sostegno e contributi utili alle nostre discussioni.
Materials
| 0.01 M sodium citrate | SIGMA – ALDRICH | ||
| 2.5% normal horse serum | SIGMA – ALDRICH | H0146 | Liquid |
| 4 % buffered formaldehyde solution | |||
| Anti-Amyloid Precursor Protein, C – terminal antibodyproduced in rabbit | SIGMA – ALDRICH | Lot 056M4867V | |
| biotinylated secondary antibody | Vector | BA-1000-1.5 | 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin |
| bone-cutting forceps | |||
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | vector laboratory | ||
| embedding cassettes | |||
| ethanol 99.9 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
| guillotine | |||
| Hematoxylin | SIGMA – ALDRICH | H3136-25G | |
| Hydrogen peroxide solution | Millipore | 88597-100ML-F | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| paraffine | paraplast plus leica biosystem | Tissue embedding medium | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | SIGMA – ALDRICH | P5368-10PAK | Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl – 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C. |
| Streptavidin HRP | ABCAM | ab64269 | Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry. |
| xylene |
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