우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.
포유류 발달 도중, 세포 운명은 유전자 발현의 특이성, 타이밍 및 공간 패턴을 정의하는 규정하는 네트워크의 설치를 통해 결정됩니다. 다능성 줄기 세포에서 유래된 배아체(EBs)는 주요 3개의 생식층의 분화를 연구하고 세포 운명 규격 동안 조절 회로를 정의하는 인기 있는 모델이었다. 조직 특이적 강화제가 프로모터와 상호 작용하여 이러한 네트워크에서 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있지만, 관련 표적 유전자에 할당하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 이를 가능 하 게 하려면, 양적 접근 증강-프로모터 접촉 및 개발 하는 동안 그들의 역학을 공부 하는 데 필요한. 여기서, EB 분화 모델에서 인핸서 및 이들의 접촉을 코그네이트 프로모터와 정의하는 4C 방법을 적용하였다. 이 방법은 상용 DNA 라이브러리 준비 키트와 호환되는 자주 절단 제한 효소, 초음파 처리 및 중첩 결찰 매개 PCR 프로토콜을 사용합니다. 이어서, 4C 라이브러리는 고처리량 시퀀싱을 실시하고 생체 정보학적으로 분석되어 선택한 프로모터와 접촉하는 모든 서열을 감지하고 정량화할 수 있습니다. 생성된 시퀀싱 데이터는 또한 분화 동안 증강-프로모터 접촉의 역학에 대한 정보를 얻기 위해 사용될 수 있다. EB 분화 모델에 대해 설명된 기술은 구현하기 쉽습니다.
마우스에서, 3.5 일 된 배아의 내부 세포 질량 (ICM)은 배아 다능성 줄기 세포를 포함합니다. ICM은 4.5일째에 에피블라스트로 발전하여 배아의 주요 3개 생식층인 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포를 생성한다. ICM내의 다능성 세포는 생체 내에서 만일시적으로 존재하지만, 마우스 배아 줄기세포(mESCs)의 확립에 의해 배양내에서 포획될 수 있다1,,2,,3. 상기 mESCs는 미분화 상태로 남아 무기한 증식하지만, 본질및 외인성 자극에 따라 그들은 또한 3개의 발달세균층의 다능상태 및 생성 세포를 빠져나갈 수 있다2,,4. 흥미롭게도, 작은 물방울에서 현탁액에서 배양될 때, mESCs는 3개의 세균 층모두로분화하는 3차원 응집체(즉, EB)를 형성한다 5. EB 형성 분석은 초기 계보 사양 프로세스를 연구하는 중요한 도구입니다.
계보 명세서 동안, 각 생식층의 세포는 특정 유전자 발현 프로그램4를획득한다. 유전자의 정확한 시공간적 발현은 코어 프로모터, 인핸서, 소음기 및 절연체6,,7,,8,,9를포함하는 다양한 시스 조절 요소에 의해 조절된다. 인핸서, 조절 DNA 세그먼트는 전형적으로 수백 개의 염기 쌍을 아우르며, 조직 특이적 유전자발현을 조정한다 8. 인핸서는 국소 염색질 구조를 조절하는 전사 인자 및 보조 인자의 결합에 의해 활성화되거나 침묵된다8,,10. 일반적으로 사용되는 기술은 게놈 전체 염색체 면역 침전 시퀀싱 (ChIP-seq) 및 시퀀싱 (ATAC-seq) 기술을 사용하여 트랜스 포사제 접근 크로마틴에 대한 분석법뒤에 있습니다. 따라서, 활성 강화제는 특이적 활성 히스톤 마크 및 증가된 국소 DNA 접근성11,,12,,13,,14를특징으로 한다. 또한, 발달 강화제는 그들의 동체프로모터와물리적 인 상호 작용을 필요로하는 것으로 추정된다8,9. 실제로, 인핸서-프로모터 접촉을 방해하는 인핸서 변이체 및 삭제가 발달기형(15)으로이어질 수 있음을 보여주었다. 따라서, 발달 유전자 발현을 조절하는 기능성 강화제의 식별을 위한 추가 정보를 제공하는 새로운 기술에 대한 필요성이 있다.
염색체 형태 포획(3C)기술(16)의발달 이후, 염색체 접촉체의 매핑은 조절 요소 들 사이의 물리적 거리를 평가하기 위해 집중적으로 사용되어 왔다. 중요한 것은, 3C 기술의 높은 처리량 변이체는 최근에 개발되어 크로마틴 단편17사이의 접촉의 고정, 소화, 결찰 및 회복을 위한 상이한 전략을 제공한다. 그 중에서도, 시투Hi-C는 3C 결찰 제품의 시퀀싱을 허용하는 인기 기술이 되어 게놈 폭18이다. 그러나, 인핸서-프로모터 접촉의 분석에 적합한 분해능에 도달하는 데 필요한 높은 시퀀싱 비용은 특정 로시의 연구에 비실용적이다. 따라서, 고해상도19,,20,,21,,22에서표적 궤위를 분석하기 위한 대체 방법이 개발되었다. 이러한 방법 중 하나인 4C는 모든 전략대 하나로 알려져 있으므로 관측점으로 선택된 사이트에 접촉하는 모든 시퀀스를 검색할 수 있습니다. 그러나 표준 4C 기술의 단점은 다른 크기의 조각을 증폭하는 역 PCR이 요구되어 작은 제품을 선호하고 고처리량 시퀀싱 후 정량화를 편향시키는 것입니다. 최근, UMI-4C는, 고유 분자 식별자(UMI)를 이용한 4C 기술의 새로운 변이체가 이러한 문제를 우회하는 정량적 및 표적 염색체 접촉 프로파일링을 위해 개발되었다23. 이 접근법은 빈번한 커터, 초음파 처리 및 중첩-결찰 매개 PCR 프로토콜을 사용하여 비교적 균일한 길이 분포를 가진 DNA 단편의 증폭을 포함합니다. 이 균질성은 짧은 시퀀스를 위한 PCR 환경 설정의 증폭 과정에서 편향을 감소시키고 공간적으로 연결된 분자/단편을 효율적으로 복구하고 정확하게 계산할 수 있게 합니다.
여기에서 우리는 EB 분화 도중 계보 유익한 전사 인자의 프로모터 와 강화제 사이 염색질 접촉을 확인하고 정량화하기 위하여 UMI-4C 기술을 적응하는 프로토콜을 기술합니다.
교수형 낙하 배양 방법은 추가적인 성장 인자 또는 사이토카인을 필요로 하지 않으며, 소정의 수의 mESCs5로부터의 EB의 균질한 집단을 재현가능하게 생성한다. 여기서 우리는 EB 분화 모델에서 계보 특이적 전사 인자의 인핸서-프로모터 접촉을 정량화하기 위해 UMI-4C 접근법으로부터 적응된 정량적 4C의 프로토콜을 기술한다. 우리는 EB 분화 도중 역동적인 방식으로 Pou5f1및 T 유전자의 프로모터를 접촉하는 염색질 지구를 확인했습니다. Pou5f1은 EB 분화 및 Pou5f1 프로모터와 그 말단 증강기 사이의 접촉 빈도 감소 동안 하향 조절되었다. 반대로, T는 EB 분화 동안 업조절되었고, 우리는 그들의 프로모터와의 접촉 주파수가 감소되는 3가지 인핸서를 확인하였다(그림3). 확인을 위해, 활성 히스톤 마크 H3K27ac의 염색질 면역침전(ChIP) 분석실험은24를수행할 수 있으며, 이러한 히스톤 마크는 인핸서 활성화및 인핸서가 불활성화(11) 동안 이 마크를 잃는 것으로 나타났다.11
표준 4C 기술은 특정 게놈부위(25)의염색질 접촉 프로파일을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 접근법은 PCR 단편 크기의 이질성에 의해 도입된 편견과 PCR 중복을 구별할 수 없기 때문에 광범위한정규화(26,,27,,28) 후에도 정량적으로 해석하기 어렵다. 우리의 정량적 4C 방법은 초음파 처리 및 중첩 결찰 매개 PCR 단계를 사용하여 단일 분자의 정량화를 허용하는 UMI-4C 기술과 크게 동일하여 고전적인 4C 접근법23의한계를 우회합니다. 그러나, 독특한 분자 식별자를 사용하는 UMI-4C와는 달리, 우리의 정량적 4C 프로토콜은 초음파 처리 단계에 의해 생성된 특정 DNA 파손에 근거를 둔 단일 분자의 정량화를 허용합니다. 이 프로토콜은 상용 DNA 라이브러리 준비 키트와 호환되며 고유한 분자 식별자를 가진 프라이머의 필요성을 없애줍니다.
우리의 프로토콜은 고려해야 할 몇 가지 주요 단계를 포함한다. 고전적인 4C 방법28에서와같이, 우리의 프로토콜의 중요한 요소는 3C 분자의 제조 동안 소화 및 결찰의 효율이다. 낮은 소화/결찰 효율성은 관심 있는 단편과의 상호 작용의 복잡성을 크게 감소시켜 분해능을 감소시킬 수 있습니다. 앞서설명한 23,프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 라이브러리 증폭을 위한 프라이머의 설계이다. 제2 PCR 반응 프라이머는 심문된 제한 부위로부터 5-15 nt에 위치해야 한다. 75nt 시퀀싱 읽기에서는 매핑을 위해 캡처 길이의 최소 40nt 를 허용합니다. 제1 PCR 반응에 사용된 프라이머는 중첩 없이 제2 프라이머의 상류로 설계되어야 하며 둘 다 효율적인 DNA 증폭을 보장하기에 충분히 특이적이어야 한다. 멀티플렉싱의 경우 프라이머는 60-65°C의m용융 온도(Tm)를 목표로 독립적으로 설계되어야 합니다. 더욱이, 다른 3C 기술에 관해서는, 정량적 4C 방법의 분해능은 프로토콜25에사용되는 제한 효소에 의해 결정된다. 이 프로토콜은 4 bp 인식 부위인 MboI를 가진 제한 효소를 사용한다. 이 효소를 가진 최대 해결책은 약 500 bp입니다, 그러나 이것은 높게 궤적 의존적이고 거의 달성되지 않습니다. 또 다른 제한은 동일한 제한 조각에 있는 요소 간에 발생하는 상호 작용을 감지할 수 없다는 것입니다. 또한 하나의 제한 사이트의 거리에서 발생하는 상호 작용은 소화되지 않은 배경과 구별할 수 없습니다. 결찰 전에 채우기 단계를 사용하면 이러한 상호 작용의 검출을 허용할 수 있다.
정량적 4C는 표적 로시의 크로마틴 접촉을 심문하는 데 이상적입니다. 그러나, 특정 PCR 증폭 단계는 동시에 조사될 수 있는 궤적의 수를 제한한다. 표적 화된 위치의 수를 증가시키는 방법은 여러 표적을 동시에 증폭시키기 위해 PCR 단계를 멀티플렉싱하는 것이지만, 이는 구현 하기 전에 사용되는 프라이머및 테스트의 호환성을 필요로 한다. 프로모터에서 크로마틴 아키텍처의 글로벌 변화가 요구되는 경우, Hi-C, PC Hi-C, 또는 HiChIP와 같은 게놈 전체 접근법이29,,30,,31보다더 적합할 것이다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 F. 르 딜리, R. Stadhouders 및 그라프 연구소의 회원들에게 조언과 토론에 감사드립니다. G.S.는 마리 스클로도우스카-퀴리 펠로우십(H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), 후안 데 라 시에르바 박사 후 펠로우십(MINECO, FJCI-2014-22946)의 지원을 받았습니다. 이 작품은 7번째 프레임 워크 프로그램 FP7 (ERC 시너지 그랜트 4D-게놈, T.G.에 부여 계약 609989), EMBL 파트너십에 스페인 경제, 산업 및 경쟁력 (MEIC) 아래 유럽 연구위원회에 의해 지원되었다, 센트로 드 엑셀로 오초아 2013-2017 및 CERCA 프로그램 일반.
0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
BSA | NEB | B9000S | 4C |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
CIP | NEB | M0212 | 4C |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
dNTP | NEB | N0447S | 4C |
ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
Knockout DMEM | 10829018 | ||
L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
MboI | NEB | R0147M | 4C |
MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |