Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri
Summary
Konvansiyonel BODIPY konjugatları, geçici olarak oluşan, kırmızı-shifted yer durumu dimerlerinin sömürülmesi yoluyla canlı hücreli tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) için kullanılabilir. Nanoskobik uzunluk ölçeğinde yaşayan memeli ve maya hücrelerindeki hücre altı nötr lipitleri ve yağ asitlerini izlemek ve çözmek için optimize edilmiş bir SMLM protokolü salıyoruz.
Abstract
Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) teknikleri konvansiyonel floresan mikroskobun optik kırınım sınırını aşmak ve hücre içi yapıları ve biyomoleküllerin dinamiklerini ~20 nm hassasiyetle çözebilir. SMLM için bir ön koşul, binlerce veri toplama çerçevesinin her birinde nokta yayma işlevlerinin mekansal-zamansal çakışmasını önlemek için karanlıktan floresan duruma geçiş yapan floroforlardır. BODIPYs konvansiyonel mikroskopikullanılan çok sayıda konjuge ile iyi kurulmuş boyalar vardır. Kırmızı-shifted BODIPY yer-hal dimerlerinin (DII)geçici oluşumu, tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) sağlayan parlak tek molekül salınımı ile sonuçlanır. Burada yaşayan maya ve memeli hücrelerinde geleneksel BODIPY konjugatları ile SMLM için basit ama çok yönlü bir protokol salıyoruz. Bu yordam, süper çözünürlüklü görüntüler elde etmek ve BODIPY konjugalarının mekano-zamansal bilgilerini ayıklamak için tek bodipy-DII durumlarını izlemek için kullanılabilir. Bu işlemi, nanoskobik uzunluk ölçeğinde yaşayan maya ve memeli hücrelerindeki lipid damlacıklarını (LD’ler), yağ asitlerini ve lizozomları gidermek için uyguluyoruz. Ayrıca, diğer floresan problarla birlikte kullanıldığında BODIPY boyaları ile çok renkli görüntüleme yeteneğini gösteriyoruz. Temsili sonuçlarımız, beslenen ve oruç lu koşullarda mayadaki BODIPY-yağ asitlerinin ve nötr lipidlerin diferansiyel uzamsal dağılımını ve hareketliliğini göstermektedir. SMLM için bu optimize edilmiş protokol, ticari olarak kullanılabilen yüzlerce BODIPY konjugasyonuyla kullanılabilir ve bu çalışmanın uygulamalarının çok ötesinde nano ölçekte biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir kaynaktır.
Introduction
Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) gibi stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ve foto-aktive lokalizasyon mikroskobu (PALM) teknikleri Abbe optik kırınım sınırı1ötesinde bilgi ile süper çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için yöntemler olarak ortaya çıkmıştır1 ,2 ve tek biyomoleküllerin dinamiklerini izlemek için3,4. SMLM ile uyumlu problar için gereksinimlerden biri, nokta yayma fonksiyonlarının (PSF) mekansal çakışmasını önlemek için herhangi bir zamanda aktif florofor sayısını kontrol edebilme yeteneğidir. Binlerce veri toplama çerçevesinin her birinde, her floresan floresan floresan floresan’ın konumu, karşılık gelen nokta yayma fonksiyonuna uygun olarak ~20 nm hassasiyetle belirlenir. Geleneksel olarak, floroforların on-off yanıp stochastic fotoanahtarlama11,2,,5 veya kimyasal olarak intrinsic yanıp sönen6ile kontrol edilmiştir. Diğer yaklaşımlar bir florojen aktive proteingeçicibağlama üzerine florojen indüklenen aktivasyon dahil7 ,8 ve toplam iç yansıma floresan (TIRF) veya hafif levha uyarma etiketli DNA oligomerlerin programlanabilir bağlayıcı-bağlayıcı olmayan9. Son zamanlarda, smlm için yeni ve çok yönlü etiketleme stratejisi bildirdi10 hangi daha önce rapor kırmızı-shifted dimeric (DII) konvansiyonel bor di-pirometan (BODIPY) durumları11,,12,13 geçici olarak şekillendirme ve özellikle heyecanlı olmak ve kırmızı-shifted dalga boyları ile tespit.
BODIPYs yaygın olarak kullanılan boyalar özellikle etiket alt hücresel bölmeleri ve biyomolekülleri yüzlerce ile boyalar14,15,16. Canlı hücrelerde kullanım kolaylığı ve uygulanabilirliği nedeniyle, BODIPY varyantları konvansiyonel floresan mikroskobu için ticari olarak mevcuttur. Burada, yüzlerce ticari olarak kullanılabilen BODIPY konjugatlarının canlı hücreli SMLM için nasıl kullanılabileceğini anlatan ayrıntılı ve optimize edilmiş bir protokol açıklıyoruz. BODIPY monomerlerinin konsantrasyonu ayarı ve uyarma lazer güçleri, görüntüleme ve veri analizi parametreleri optimize edilerek, canlı hücrelerde yüksek kaliteli süper çözünürlüklü görüntüler ve tek molekül izleme verileri elde edilir. Düşük konsantrasyonda (25-100 nM) kullanıldığında, BODIPY konjugatları aynı anda kırmızı kaydırmalı kanalda SMLM ve konvansiyonel emisyon kanalında korgöreceli konvansiyonel floresan mikroskopi için kullanılabilir. Elde edilen tek molekül verileri hareketsiz yapıların mekansal organizasyonunu ölçmek ve canlı hücrelerdeki moleküllerin diffüzive durumlarını ayıklamak için analiz edilebilir17. BODIPY problarının hem yeşil hem de kırmızı formlarda kullanılabilirliği, diğer uyumlu floroforlarla doğru kombinasyonda kullanıldığında çok renkli görüntülemeye olanak tanır.
Bu raporda, bodipy-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 kırmızı ve lisotracker-yeşil birden fazla renk kullanarak canlı hücre SMLM verilerinin elde alınması ve analiz için optimize edilmiş bir protokol sağlık edin. Canlı maya ve memeli hücrelerindeki yağ asitlerini ve nötr lipitleri ~30 nm çözünürlükte çözeriz. Ayrıca maya hücrelerinin metabolik durumlarına bağlı olarak dıştan eklenen yağ asitlerinin mekansal dağılımını düzenlediğini de gösteriyoruz. Eklenen BODIPY-yağ asitlerinin (FA) endoplazmik retikulum (ER) ve lipid damlacıklarına (LD) beslenen koşullar altında lokalize olduğunu, BODIPY-FAs’lerin ise açlık üzerine plazma zarında LD dışı kümeler oluşturduğunu görüyoruz. Bu tekniğin uygulanmasını yaşayan memeli hücrelerindeki görüntü ve ld’lere de genişletiyoruz. Konvansiyonel BODIPY konjugatlarını kullanarak SMLM için optimize edilmiş protokolümüz, mevcut sayısız BODIPY konjugatları ile nano ölçekte biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir kaynak olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, geleneksel BODIPY konjugatlarının uzamsal çözünürlükte büyüklük iyileştirme sisiyle SMLM görüntülerini elde etmek için nasıl kullanılabileceğini gösterdik. Bu yöntem, daha önce rapor edilmiş, kırmızı yalıtılı DII durumları geleneksel BODIPY boyalar, geçici olarak iki moleküler karşılaşmalar yoluyla form sömürü dayanmaktadır. Bu durumlar özellikle heyecanlı ve kırmızı kaymış dalga boyları ile tespit edilebilir ve seyrek ve SMLM için yeterince kısa ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında bildirilen araştırma, R21GM127965 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
Referenzen
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2′-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
