אפיון חלבונים סלולריים עם החמצון בתוך תא מהיר לפוטוכימיקלים של חלבונים

1. הגדרת מערכת זרימה IC-FPOP כדי להתחיל את ההרכבה של מערכת הזרימה, חותכים את סיליקה התמזגו באמצעות אבן מחשוף לגודל. מערכת הזרימה IC-fpop דורש 4 12 ס”מ ו 1 17 התמזגו סיליקה ס”מ עם קוטר פנימי (ID) של 450 יקרומטר ו בקוטר החיצוני (OD) של 670 יקרומטר, 2 24 ס”מ ו-10 ס מ עם מזהה של 1 40 יקרומטר ו-OD של 75 יקרומטר , ולבסוף 2 57 ס מ עם מזהה של 150 יקרומטר ו-OD של 360 יקרומטר.הערה: כאשר חותכים את צינור סיליקה, לגרד בעדינות את ציפוי פוליאימיד ולהתכופף כדי לקבל את החתך הנקי. בדוק כדי לוודא שהוא חתוך ישר (זה הכרחי כדי להבטיח לא מחסומים או בטופס הדלפות). הגדרת 15 התקשרויות באמצעות שרוולים בעלי הדוקה (0.0155 “id x 1/16” od עבור 360 יקרומטר od סיליקה אבובים ו0.027 “id x 1/16” od עבור ב670 יקרומטר ה-סיליקה הצינורות) עם הצצה באגוז סופר ללא מקום התחתון שטוח עבור 1/4-28 “od ו-super מהיר ferang, הטבעת, tefzel (etfe), 1/4-28 שטוח למטה, עבור 1/16” OD. בניית חיבורים לפי פרוטוקול היצרן (איור 1). מקום 6 מגנטים גליליים קטנים ב 1 500 μL מזרק. למלא את המזרק יחד עם עוד 500 μL מזרק ושני 5 מ ל מזרקים עם מאגר ולהסיר אוויר. מיקום על משאבת המזרק כפי שמוצג על איור 2א.הערה: 5 מזרקים mL גדולים יותר מאשר 500 μL מזרקים, כך מרווח נדרש כדי להדק את כל הזרקים בו זמנית במקום (איור 2B). להדק משאבת המשאבה בפקק כך מזרק התא יש בערך 50 μL עזב כאשר המנוע דוכנים. . זה ישאיר מקום לרודרים מגנטיים (איור 2C-D).התראה: אם משאבת המזרק מפעילה לחץ על המגנטים, הם יג’אם את המזרק ועלולים לגרום למזרק להישבר. באמצעות מתאם Luer, חבר שסתום ידני לכל מזרק. להרכיב את צינור סיליקה כפי שמוצג באיור 3.הערה: הפתיל קו עם התאים + H2O2 כל הדרך דרך הצלב לצד השני. ואז להכניס אותו לתוך צינורות סיליקה 450 יקרומטר ID. הנדן מאגר במזרק 5 מ ל יזרום בקצב מהיר יותר מאשר התאים H2O2. עם מאגרי המעטפת משני הצדדים, התאים יהיו ממוקדים בצורה בודדת להקרנה. מיקום מערכת זרימה ליד לייזר. באמצעות מצית, לשרוף את ציפוי סיליקה על צינורות 450 יקרומטר מזהה כדי ליצור חלון עבור הקרנה לייזר. מניחים שהוא מערבב מגנטי מעל מזרק התא המכיל את ששת המגנטים. הגדר משאבת מזרק ל 492.4 μL/min עבור קצב הזרימה הסופי של 1,083.3 μL/min. מאגר זרימה דרך המערכת שלוש פעמים כדי לרוקן את המערכת ולבדוק את כל הדליפות. למקד את לייזר excimer על אבובים סיליקה באמצעות עדשה קמורה. לאחר ההתמקדות, בדוק את חלון ההקרנה על ידי הצבת פיסת נייר קטנה מאחורי אבובים סיליקה ולהפעיל את הלייזר. למדוד את האזור נשרף מן ההקרנה. חשב את תדר הלייזר הדרוש באמצעות חלון ההקרנה וקצב הזרימה כדי לקבל חלק הדרה של אפס.הערה: אנרגיית הלייזר המומלצת לניסוי IC-FPOP היא ≥ 120 mJ. כדי לקבל חלק הדרה של 0 עם חלון הקרנה של 2.58 מ”מ ושיעור זרימה של 1083.3 μL/min, התדר צריך להיות 44. להלן המשוואות הדרושות לחישוב תדר הלייזר אם חלון ההקרנה, קצב הזרימה ושבר ההדרה ידועים.כאשר w הוא אמצעי האחסון nL, x הוא רוחב ספוט לייזר ב mm, y הוא מזהה אבובים של סיליקה ב-μm, v הוא הנפח הכולל μL, b הוא שבר הדרה, a הוא קצב הזרימה ב-μL/min, ו-f הוא התדר ב-Hz. 2. לעשות כיבוי ו-H2O2 לעשות כיבוי המכיל 100 mM N-tert-בוטיל-אלפא-פנילטין (PBN) ו 100 mM N, N’-diמתילתיואוראה (DMTU). מחלק 11 מ ל של כיבוי עבור כל מדגם לתוך שפופרת חרוט 50 mL. לדלל H2O2 כדי 200 מ”מ. כל דוגמה מחייבת 500 μL של H2O2.הערה: ניתן לעשות את היום שלפני ולאגור ב -4 ° c בלילה, מוגן מפני אור. 2O22 יש לעשות טרי ביום של ניסויים. 3. לאסוף תאים לגדול תאים בבקבוקון T175 על 70-90% שליטה. הסר מדיה ושטוף עם מאגר.הערה: מאגרים טיפוסיים לשימוש הם תרבות תא כיתה מלוחים באגירה של דולקקו פוספט (DPBS) או תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS). ניתוק תאים באמצעות טריפסין-EDTA או במגרד. מנותקת פעם מחדש ב 10 מ ל של מאגר ולספור את התאים. ספין למטה, להסיר את מאגר טריפסין-EDTA, ולהשעות מחדש לעשות 2 x 106 תאים/mL. Aliquot 500 μL של התאים לכל מדגם.הערה: עבור כל תנאי, לבצע לפחות 3 דגימות לייזר, ו 3 אין שולטת לייזר. 4. ביצוע IC-FPOP למלא את שני 5 מזרקים mL עם מאגר, מזרק 500 μL המכיל את מגנטים עם התאים, ואת הסופי 500 μL מזרק עם H2O2. . תדליק את הטירר המגנטי ספייק ב 220 μl של diמתיל סולפוקסיד (dmso) לאחד סדרת מחלקים של כיבוי, בעדינות לערבב, ומקום מאחורי מערכת הזרימה כדי לאסוף דגימות הקרינה. תוספת של DMSO יהיה לעכב מתיונין אנדוגניים סולפוקסיד רדוקטאז. הפעל לייזר, המתן 7 s ולאחר מכן הפעל את מערכת הזרימה. לאחר סיום המדגם זורם, לכבות את הלייזר, ולערבב בעדינות את הכיבוי עם המדגם שנאסף. מניחים את זה בצד במהלך השלבים 4.5 ו 4.6. למלא את כל ארבעת מזרקים עם המאגר התאים מושעה ולזרום אותו דרך מערכת הזרימה. לאחר שהמערכת מסתיימת בשטיפה, חזור על שלבים 4.1 ו-4.2. הפעל את הזרימה ללא הקרנה. זהו לא שליטה לייזר לחשבון על חמצון הרקע בתאים. בעוד המדגם הבא פועל, ספין למטה את המדגם הקודם ב 450-800 x g עבור 5 דקות, להסיר את הממס, ולהשעות מחדש ב 100 μl של מאגר פירוק התא כמו radioimmunoprecipitation מאגר (ריפה). העבר את הדגימה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה והקפא הבזק בחנקן נוזלי. כאשר כל הדגימות סיימו לפעול, פרק את מערכת הזרימה לניקוי. להיפטר אבובים סיליקה השתמשו ולנקות את כל החיבורים האחרים על ידי sonicating עבור 1 h ב 50% מים: 50% מתנול. נקה את הזרקים לפי הוראות היצרן. 5. תקציר . מעכל את כל התאים התחילו בהתדלחם הדגימות והחום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר החימום, לצנן את הליפוסט על הקרח עבור 15 דקות. הוסף 25 יחידות של נוקלאז כדי לעכל DNA ו-RNA ו-דגירה בחדר ממוזג עבור 15 דקות. דגימות ספין באמצעות צנטריפוגה העליון הטבלה ב 16,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. לאסוף את סופרנטנט ולהעביר אותו צינור מיקרוצנטריפוגה נקי. בדוק את ריכוז החלבון בעזרת ערכת שיטת החלבונים. העברת 20-100 μg של דגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי ולהביא 100 μL. להפחית דגימות עם 20 מ”מ dithio, (DTT) ב 50 ° c עבור 45 דקות. לצנן את הדגימות בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות. בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. מוגן מפני אור הוסף אצטון טרום מקורר בחלבון 1:4 היחס: אצטון. לערבב דגימות ולמקם ב-20 ° c בלילה. למחרת בבוקר, לסובב דגימות ב 16,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. הסר את הסופרנטאנט והוסף 50 μL של 90% אצטון מקורר. מערבבים דגימות ו למטה ב 16,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. להסיר אצטון ולתת דגימות יבש על ידי השארת כובעים של המיקרוצנטריפוגה לפתוח עם מחיקה חינם של מוך מכסה את החלק העליון. לאחר הדגימות התייבשו, השהה מחדש את הגלולה חלבון עם 10 מ”מ מאגר טריס pH 8. השעיה מחדש 20 μg של טריפסין ב 40 μL של 10 מ”מ מאגר טריס pH 8. הוסף 2 μg של טריפסין (מסה: יחס המונים של טריפסין 1:50 מדגם). מודטה דגימות ב 37 ° c ללילה. בבוקר שלמחרת בודקים את הריכוז הפפטיד בעזרת שיטת מבחן פפטיד. לאחר שהדוגמא הוסרה לצורך הבחינה הפפטיד, כיבוי הטריפסין של העיכול על ידי הוספת חומצה פורמית לדגימות (הריכוז הסופי הוא 5% חומצה פורמית). לאחר ריכוז פפטיד הסופי נקבע, להעביר 10 μg של כל דגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי. פעולה זו מבטיחה שאותה כמות של כל דגימה תהיה מנותח. יבש את המדגם באמצעות צנטריפוגה ואקום. פעם אחת מיובש מחדש עם 20 μl של המסה ספקטרומטריה כיתה 0.1% החומצה פורמית. העבר דגימות לבקבוקונים באמצעות דוגם אוטומטי. 6. כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריה מאסיבית כדי להתאים שינויים FPOP לנתח את התא מתעכל ליפוסט באמצעות ניתוח LC-MS/MS. השתמש בשלבים ניידים של 0.1% החומצה פורמית במים (A) ו 0.1% החומצה פורמית ב acetonitrile (ב). טען 0.5 μg של דגימה אל 180 יקרומטר x 20 מ”מ סי18 (5 יקרומטר ו-100 Å) השמנה עמודה ולשטוף מדגם עם 99% (a) ו-1% (ב) עבור 15 דקות. באמצעות 75 יקרומטר x 30 ס”מ סי18 (5 יקרומטר ו 125 Å) טור אנליטי, להפעיל את שיטת ההפרדה האנליטית עם קצב הזרימה של 0.300 μl/min החל ב 3% (ב) עבור דקה אחת ולאחר מכן כבש 10% (ב) מ 1-2 min. הרמפה הבאה ל 45% (ב) מ 2-100 דקות מכן 100% (ב) מ 100-110 min. לנקות את העמודה על ידי החזקת 100% (ב) מ-110-115 min. מחדש את העמודה על-ידי המשך 3% (ב) מ 115-116 דקות ולהחזיק ב -3% (ב) מתוך 116-130 דקות. הגדר את שיטת הרכישה MS כדי לקבל רזולוציה של 60,000 עם טווח סריקה m/z של 375-1500. הגדר את בקרת הרווח האוטומטי (AGC) היעד כדי 5.0 x 105 עם זמן הזרקה מקסימלית של 50 ms. במהלך הרכישה MS, בחר את היונים המקודמות עם מדינות החיוב 2-6 עבור בידוד באמצעות רכישה תלויה נתונים (דה) עם חלון בידוד של 1.2 m/z וזמן מחזור של 4 s. בחר את הפפטידים עם סף עוצמה של 5.0 x 104 עבור hcd הפעלה עם אנרגיה מנורמלת מוגדר 32%. להוציא את פפטידים לאחר 1 MS/MS הרכישה עבור 60 s. הגדר את הרזולוציה MS/MS ל 15,000 עם יעד AGC של 5.0 x 104 ו זמן הזרקה מקסימלית של 35 MS. 7. עיבוד נתונים חפש בקובצי ה-RAW על תוכנת ניתוח חלבון זמינה כנגד מסד נתונים של חלבונים רלוונטיים ואנזים התקציר הרלוונטי. כאן, השתמשו במאגר המידע של האדם השוויצרי-פרוט ובטריפסין. הגדר את מסה הקודמן כדי לחפש בין 350 עד 5,000 Da ו עמידות המונית של 10 עמודים לדקה. יכול להיות לכל היותר 1 מחשוף האתר החמיץ עם אורך פפטיד בין 6 כדי 144 שאריות. מגבלות אלה מקלות על חיפוש במסד נתונים. הגדר את יוני הקטע עמידות מסה מקסימלית ל 0.02 Da עם carbamidomethyl (+ 57.021) כשינוי סטטי וכל שינויי FPOP מ -17 חומצות אמינו כשינוי דינאמי (איור 4 היא דוגמה לזרימת העבודה של ניתוח החלבון המשמשת לזיהוי שינויי fpop).הערה: שינויים FPOP על סרין וטראונין אינם כלולים בחיפוש עקב הפעילות החוזרת התחתונה שלהם עם רדיקלים הידרוקסיל. חפש עם מסד נתונים דמה עם שיעור גילוי שווא של 1% ו-5%. לאחר הקבצים מסתיים החיפוש לחשב את מידת השינוי FPOP. פתח פרוטדום גלה 2.2, רצף ייצוא, מיקומי שינוי, הצטרפות חלבון, קובץ ספקטרום, השפע מקודמן, ואת זמן השמירה מידע. חישוב היקף השינוי מהמשוואה 4:אזור EIC שונה הוא אזור כרומטוגרפי של פפטיד ספציפי עם שינוי רדיקלי הידרוקסיל. אזור EIC הוא האזור הכולל כרומטוגרפי של אזורים ששונו ולא השתנו של הפפטיד הספציפי. מידת החמצון מחושבת בדגימות עם ובלי הקרנה. המדגם נמנע הקרנה (שליטה) חשבונות עבור כל חמצון הרקע שהיה יכול להיות נוכח בתאים לפני ואחרי H2O2 חשיפה. הפקדים מופחתים מדגימות ההקרנה כדי לסייע בבידוד של שינויים ספציפיים של FPOP.