유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

클러스터된 정기적으로 간격을 두는 짧은 palindromic 반복 (CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 시스템은 게놈^1에있는 전례 없는 표적으로 한 수정을 제공하는 과학적인 돌파구입니다. CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9 단백질과 가이드 RNA(gRNA)와 표적 특이적 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스 활성화 CRISPR RNA(트라크RNA)^2로 구성됩니다. gRNA는 Cas9 단백질을 게놈내의 특이적 궤적, 20개의 뉴클레오티드가 crRNA에 상보적이며, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접하여 지시한다. Cas9 단백질은 표적 서열에 결합하고 오류가 발생하기 쉬운 비동동성 단부 접합(NHEJ) 또는 고충실도 상동성 상동성 수리(HDR)^3,,4,,5에의해 수리되는 이중 가닥 파손(DSB)을 유도합니다. NHEJ는 삽입 및 /및 삭제 (indels)로 이어지며, 따라서 코딩 서열이 표적화 될 때 기능의 유전자 손실로 이어집니다. HDR은 상동성 서열을 포함하는 복구 템플릿의 존재에 정확한 게놈 편집에 이르게^3,,4,,5. NHEJ와 HDR은 각각 녹아웃 및 노크 인 마우스를 생성하기 위해 활용되었습니다.

CRISPR/Cas9 시스템은 뛰어난 효능과 충실도를 갖춘 GM 마우스의 생성을 현저히 가속화했지만, 이러한 방법을 적용하는 과학자들은 종종 기술적 인 과제를 겪습니다. 첫째, 종래의 프로토콜은 수정란^6,,7의프로핵에 CRISPR 편집 도구를 도입하기 위한 미세 주입이 필요하다. 이 기술은 시간이 많이 걸리며 일반적으로 광범위한 교육이 필요합니다. 따라서 여러 그룹이 미세 주입을 전기 천공^{8,,9,10,,11,12,13으로}대체했습니다. 그러나, 초기 전기 천공 프로토콜에서 신선한 배아는 전기 천공에 사용되었다. 이는 각 실험 전에 신선한 배아를 준비하는 것이 어렵기 때문에 또 다른 문제를 일으켰다^14.

최근 우리및 다른 사람들은 동결해동배아의 사용을 결합하여 게놈 편집을 위한 전기포공화, 이는 GM^{마우스(15,,16)의}생성을 용이하게 한다. 이 프로토콜은 고급 배아 조작 기술이없는 연구원이 고효율로 인간 질병의 동물 모델을 신속하게 생성 할 수 있게합니다. 이 프로토콜은 또한 설립자^16에서유전적 이질성과 같은 GM 마우스 생성에 대한 실질적인 과제를 현저히 감소시킨다. 모자이크주의를 극복하기 위해, 우리는 게놈의 첫 번째 복제 전에 편집이 발생하는지 확인하기 위해 배아 해동 후 1 시간 이내에 CRISPR 시약의 전기 천공을 수행합니다. 또 다른 개선은 바람직하지 않은 모자이크주의를 감소시키기 위해 Cas9 mRNA 대신 Cas9 단백질의 사용을 포함한다^17. 또한, 우리는 2 세포 단계^16에발달 속도를 증가시키는 1 세포 배아 동결 보존을위한 최적의 방법을 개발 : 태아 소 혈청 (FBS)의 사용은 극적으로 수정 후 동결 해동 oocytes의 생존을 향상, 아마도 동결 해동 비 수정 oocytes더^탄력18을만드는 동일한 메커니즘에 의해.

여기에서 우리는 1 세포 C57BL/6J 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법을 포함하여 동결 해동 된 배아를 사용하여 GM 마우스의 생성을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 여기에는 1) gRNA 설계, CRISPR 시약 제제 및 조립이 포함됩니다. 2) IVF, 동결 보존, 및 1 세포 배아의 해동; 3) CRISPR 시약의 전기 화동결 해동 배아; 4) 가성 임신 한 여성 마우스의 난관으로 배아 전달; 및 5) F0 설립자 동물의 게노티핑 및 서열 분석.