Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM’s) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.
Het bestuderen van meerdere post-translationele modificaties (PTMs) van eiwitten is een cruciale stap om PTM crosstalk te begrijpen en meer holistische inzichten te krijgen in de eiwitfunctie. Ondanks het belang van multi-PTM verrijking studies, weinig studies onderzoeken meer dan een PTM per keer, deels te wijten aan de kosten, tijd, en grote eiwithoeveelheden die nodig zijn om meerdere wereldwijde proteomische analyse van PTM’s uit te voeren. De in dit protocol beschreven affiniteitsverrijking met één pot overwint deze barrières door de gelijktijdige identificatie en kwantificering van peptiden met lysineresiduen die acetylatie en succinylation PTM’s met lage hoeveelheden monster bevatten, mogelijk te maken Input. Het protocol omvat de voorbereiding van eiwitlysaat uit muizenlevers van SIRT5 knock-out muizen, prestaties van trypsine spijsvertering, verrijking voor PTM’s, en de prestaties van massaspectrometrische analyse met behulp van een data-onafhankelijke acquisitie (DIA) workflow. Omdat deze workflow het mogelijk maakt om twee PTM’s uit hetzelfde monster tegelijkertijd te verrijken, biedt het een praktisch hulpmiddel om PTM-crosstalk te bestuderen zonder grote hoeveelheden monsters te vereisen, en het vermindert de tijd die nodig is voor de voorbereiding van monsters, gegevens acquisitie en analyse. De DIA-component van de workflow biedt uitgebreide PTM-specifieke informatie. Dit is vooral belangrijk bij het bestuderen van PTM site lokalisatie, omdat DIA uitgebreide sets van fragmentionen biedt die computationeel kunnen worden ontcijferd om onderscheid te maken tussen verschillende PTM-lokalisatie-isovormen.
Een groot aantal post-translationele wijzigingen reguleren dynamisch eiwitten en trajecten door effecten op de activiteit1, signalering2, en omzet3,4. Eiwitkinasen worden bijvoorbeeld geactiveerd of gedeactiveerd door de toevoeging van fosfaatgroepen5, en histonacetylatie en andere wijzigingen bieden een mechanisme om de chromatinestructuur te veranderen en dienen als transcriptieregulerende mechanismen6,7. In de afgelopen jaren is gebleken dat meerdere PTM’s in overleg werken of concurreren om de eiwitfunctie of activiteit8,9,10,11te reguleren . Daarom is het begrijpen van PTM crosstalk een opkomende behoefte in PTM-onderzoek. De meeste beschikbare proteomische workflows om PTM-sites te identificeren en te kwantificeren, richten zich echter op afzonderlijke wijzigingen, in plaats van het samenspel van meerdere wijzigingen. De beschreven workflow correleert specifieke eiwitmodificatie “hot-spots” en lysine residuen die worden gewijzigd door meerdere verschillende PTM’s.
Er is een groeiende behoefte in de wetenschappelijke gemeenschap aan haalbare methoden om meerdere PTM’s tegelijkertijd te bestuderen12. De meeste methoden om de sites van meerdere soorten PTM’s wereldwijd te identificeren en te kwantificeren zijn uitdagend vanwege de hoge kosten en hoeveelheid weefsel die nodig zijn12,13. Niet alleen zijn multi-PTM verrijking experimenten tijdrovend in termen van monster voorbereiding, gegevensverwerving, en data-analyse, maar deze studies vereisen meestal grote en vaak onbetaalbaar hoeveelheden eiwit11. Hier beschreven is een protocol voor gelijktijdige verrijking en analyse van meerdere PTM’s, die ook een aantal van deze barrières aanpakt en grootschalige PTM-profilering mogelijk maakt en crosstalk tussen verschillende PTM’s beoordeelt14. Deze one-pot workflow schetst een praktische manier voor biomedische onderzoekers om wereldwijd meerdere PTM’s te profileren, gecoöpgemodificeerde peptiden te identificeren en PTM-crosstalk op een efficiënte en kosteneffectieve manier te bestuderen14,15.
Hier wordt deze methode tentoongesteld door mitochondriale eiwitacytie te onderzoeken, die meer dan 50 jaar geleden voor het eerst werdbestudeerd. Het concentreert zich specifiek op lysineacetylatie17 en succinylation18, met inbegrip van het medeoptreden van deze wijzigingen op eiwitten en zelfs co-modificatie op peptideniveau. Omdat de studie gebruik maakt van een knock-outmuismodel van Sirtuin 5 (SIRT5), is gekozen om zich te richten op de verrijking van acetylatie- en succinylation-locaties. Dit besluit is genomen omdat succinylation sites zijn het doelwit van SIRT5 desuccinylase en zal dus naar verwachting een aanzienlijke upregulation in KO muizen, waardoor ze de meest relevante PTM’s in dit geval. Beide PTM’s zijn biologisch relevant zoals onlangs samengevat door Carrico et al.19. In het algemeen vertoont acetylatie belangrijke effecten op genexpressie en metabolisme, en succinylation is gemeld om het metabolisme en functie20te reguleren.
Het beschreven protocol kan worden uitgevoerd met een lage hoeveelheid eiwitinputmateriaal (bijvoorbeeld 1 mg eiwitlysaat) en vermindert de totale duur van het experiment door de tijd die wordt besteed aan monsterverwerking, MS-acquisitie en gegevensanalyse te verkorten. Er wordt een werkstroomschema opgegeven in figuur 1. We hebben ook nog lagere hoeveelheden uitgangsmateriaal gebruikt (tot 100 μg eiwitlysaat, waardoor de hoeveelheid kralen dienovereenkomstig wordt gebruikt), wat zoals verwacht de totale opbrengst van geïdentificeerde acylated peptiden vermindert; echter, het biedt nog steeds zeer waardevolle resultaten en kwantificeerbare acylated peptiden.
Hoewel zogenaamde top-down of middle-down workflows doorgaans geen proteolytische spijsverteringsbenaderingen gebruiken (en dus de connectiviteit van meerdere PTM’s binnen één eiwit behouden), richt dit protocol zich op een op peptide-gebaseerde affiniteitsverrijkingsbenadering om extra diepte en gevoeligheid te krijgen voor PTM-identificatie en kwantificering(figuur 1). Bovendien maakt deze peptide-centric workflow gebruik van moderne massaspectrometriemethoden, waaronder 1) een combinatie van data-afhankelijke acquisitie (DDA) om spectrale bibliotheken te genereren, en 2) data-onafhankelijke acquisitie (DIA) voor nauwkeurige PTM-kwantificering in een labelvrije workflow.
DIA workflows overwinnen sampling stochasticiteit van typische DDA scan schema’s door uitgebreid fragmenteren alle peptide signalen binnen de bemonsterde m / z bereik21. Deze functie is ook zeer gunstig in termen van site lokalisatie, omdat het gemakkelijker is om informatie te krijgen over welke specifieke fragment ionen worden gewijzigd binnen het peptide. Daarnaast maken DIA-workflows identificatie en kwantificering van kleine PTM-peptide-isovormen met identieke voorloper-ionen mogelijk. DIA-methoden kunnen ook een specifieke PTM-sitelokalisatie binnen een peptide bepalen op basis van specifieke overeenkomstige fragmentionen die te allen tijde uitvoerig worden gemeten. Dda-benaderingen maken echter vaak gebruik van “dynamische uitsluitingsfuncties” die meerdere steekproeven van MS/MS voor dezelfde voorloper-ion uitsluiten, waardoor kleine PTM-isovormen ontbreken.
De hier beschreven gelijktijdige verrijkingsstrategie is bij uitstek geschikt voor studies die zullen profiteren van de wereldwijde profilering en kwantificering van meerdere PTM’s, het onderzoeken van PTM-crosstalk en het begrijpen van de dynamische interacties van posttranslationele wijzigingen. Identificatie van meerdere verrijkte PTM’s in één gecombineerde workflow zijn beschreven door: wereldwijde, seriële of parallelle verrijking van PTM met proteolytische peptiden, of als alternatief door de analyse van intacte eiwitten. In vergelijking met seriële verrijking van acetylatie en succinylation werd vastgesteld dat de efficiëntie van de éénpotige methode zeer vergelijkbaar wasmet 14. Deze alternatieve protocollen vereisen aanzienlijke hoeveelheden uitgangsmateriaal en tijd en kunnen onbetaalbaar zijn. Het one-pot protocol daarentegen biedt een goedkope en efficiënte methode voor de verrijking van meer dan één PTM met latere analyse en identificatie.
Muis leverweefsels worden verkregen uit SIRT5 knock-out muizen en worden hier gebruikt als uitgangsmateriaal. Dit protocol kan ook worden uitgevoerd voor eiwitlysaten uit verschillende weefsels of celkweekexperimenten. Dit protocol kan worden toegepast op eiwitlysaten verkregen uit weefsels of celkweekpellets.
Dit protocol beschrijft een nieuwe techniek voor gelijktijdige meervoudige PTM verrijking om PTM crosstalk effectiever te begrijpen. Alternatieve methoden om deze doelstelling te bereiken zijn meestal onbetaalbaar tijdrovend en duur, en ze vereisen grote hoeveelheden eiwit om succesvol te zijn11,13. Dit protocol presenteert een multi-PTM verrijking workflow die incubatie in antilichaam-geconjugeerde kralen voor twee PTM’s tegelijk omvat om de algehele efficiëntie van het experiment te verbeteren. Deze methode omvat ook het gebruik van DDA voor spectrale bibliotheekgeneratie en DIA MS-acquisities om de peptiden te detecteren en te kwantificeren die aanwezig zijn met verminderde interferentie van fragmentionen22,23. Softwareprogramma’s, zoals MS database zoekmachines worden gebruikt om gegevens van DDA-overnames te analyseren en te kwantificeren, terwijl Kwantitatieve Proteomics Software24 en specifieke DIA Quantitative Analysis Software25 nodig zijn om de complexe spectra van DIA-acquisities te interpreteren.
Er zijn verschillende kritieke stappen binnen dit protocol die zorgvuldig moeten worden gevolgd. Aangezien het belangrijkste doel van het protocol is om voor meerdere PTM’s tegelijk te verrijken, is de antilichaam-affiniteitsverrijkingsstap (sectie 2) van cruciaal belang voor het succes van het experiment. Bij het uitvoeren van wasbeurten op de kralen, is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat geen van de kralen per ongeluk worden aangezogen. Ervoor zorgen dat de ureeconcentratie is verdund tot 1 M voorafgaand aan de spijsvertering met trypsine (stap 1.8) is ook noodzakelijk. Hoewel 8 M urea eerder vereist is in het protocol voor eiwitoplosbaarheid, zullen ureaconcentraties boven 1 M de enzymatische activiteit van trypsine remmen. Daarnaast is het belangrijk om de pH van het monster in het hele protocol consistent te controleren. Dit is vooral belangrijk voorafgaand aan de spijsvertering. Als de pH van het monster en de trypsineoplossing niet voldoende worden geneutraliseerd voorafgaand aan de incubatie, kan dit resulteren in een inefficiënte spijsvertering waarbij veel decolletéplaatsen kunnen worden gemist, wat resulteert in minder peptide-identificaties.
Een paar wijzigingen in het protocol kan nuttig zijn bij de voorbereiding van monsters. Voor een eiwitlysaat dat is verkregen uit 1 mg uitgangsmateriaal, kan een kwart van de antilichaamkralen in elke PTM-scanbuis worden gebruikt als een kosteneffectief alternatief. Een grotere hoeveelheid uitgangsmateriaal kan worden gebruikt voor betere resultaten, zolang de hoeveelheid gebruikte antilichaamkralen proportioneel wordt verhoogd. Een andere wijziging die de workflow kan verbeteren is om monsters te verteren met een andere protease in aanvulling op trypsine. Deze wijziging zou resulteren in meer variabiliteit in de peptiden gespleten, het verstrekken van een verhoogde dekking van eiwitresten. Hoewel niet nodig, wordt aanbevolen dat trypsine een van de enzymen zijn die worden gebruikt voor PTM-analyse vanwege de hoge decolletéspecificiteit26.
Een beperking van dit protocol is dat de onderzochte PTM’s vergelijkbare chemiemoeten hebben om gelijktijdig14te worden verrijkt . De procedures voor de verschillende antilichaam-geconjugeerde kralen moeten vergelijkbaar zijn, met behulp van soortgelijke oplosmiddelen en oplossingen, met inbegrip van soortgelijke elutie voorwaarden, en bij voorkeur van dezelfde leverancier. Om deze reden gebruikt de hier geschetste methode consequent acetylatie en succinylation als voorbeeld, die beide antilichaamgeconjugeerde kralen gebruiken (Cell Signaling Technology, Inc). Hoewel deze methode theoretisch kan worden toegepast op een willekeurig aantal PTM’s, zouden aanvullende studies nodig zijn om de exacte beperking van het protocol in dit verband te beoordelen. Aangezien dit een op antilichamen gebaseerde verrijkingsmethode is, kan de methode bovendien alleen zorgen voor een relatieve kwantificering van PTM-sites.
In vergelijking met bestaande multi-PTM verrijkingsmethoden is deze workflow een haalbaarder en kosteneffectiever alternatief. Uit dit experiment werd geconstateerd dat de werkzaamheid van deze methode zeer goed vergelijkt met alternatieve methoden, zoals individuele of seriële verrijkingen. Figuur 2B toont aan dat het mediane CV voor gemodificeerde peptidepiekgebieden daadwerkelijk is verlaagd in de one-pot-methode in vergelijking met single-PTM-verrijkingen en seriële PTM-verrijkingen13. We hebben de experimentele resultaten verder geanalyseerd waarin kwantificeringen op locatieniveau voor acetylatie of succinylation werden beoordeeld. Bovendien toonde de correlatieanalyse van Spearman (figuur 2C,D) aan dat de ptm-verrijking met één pot op dezelfde manier heeft gepresteerd als de verrijkingsworkflows voor één PTM. Dit gold ook voor de peptide- en fragment-niveau correlaties. Dezelfde constatering voor alle drie de correlaties bij het vergelijken van één pot met seriële PTM-verrijking.
Dit protocol stelt onderzoekers in staat om fascinerende biologische inzichten te maken in PTM crosstalk op een snelle en kosteneffectieve manier. De DIA-component van de workflow stelt onderzoekers in staat om meer te begrijpen over PTM’s, omdat het informatie biedt over locatielokalisatie en uitdagingen overwint, zoals een lage locatiebezetting van PTM’s. Voorloper-ionen zijn meestal uitgesloten bij DDA, wat vooral belangrijk is bij het bestuderen van PTM’s, omdat de bezetting van de site vaak laag is tot het punt waarop deze peptiden niet worden geselecteerd voor MS/MS, maar nog steeds cruciale informatie bevatten. Follow-up experimenten kunnen worden uitgevoerd om de bovengrens van hoeveel PTM’s gelijktijdig kunnen worden verrijkt met behulp van deze methode te beoordelen. Een toekomstige verbetering van deze workflow kan de ontwikkeling van meer geavanceerde softwareplatforms omvatten om de analyse van sitelokalisatie en PTM-sitebezetting verder te automatiseren.
The authors have nothing to disclose.
We erkennen de steun van de NIH gedeelde instrumentatiesubsidie voor het TripleTOF-systeem aan het Buck Institute (1S10 OD016281). Dit werk werd ook ondersteund door het National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 aan B.S.) en het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 aan Eric Verdin; R01 DK090242 aan Eric Goetzman). X.X. werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (NIH grant T32GM8806, aan Judith Campisi en Lisa Ellerby), N.B. werd ondersteund door een postdoctorale beurs van de Glenn Foundation for Medical Research.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |