Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

Em comparação com polímeros sintéticos, proteínas naturais multidomínios têm uma estrutura uniforme com um número bem controlado e tipo de subdomínios¹. Esse recurso geralmente leva a uma melhor função biológica e estabilidade^2,3. Muitas abordagens, como acoplamento de ligação de dimisina à base de cisínea e tecnologia de DNA recombinante, foram desenvolvidas para a construção de uma proteína polimerizada com múltiplos domínios^4,5,6,7. No entanto, o método anterior sempre resulta em uma sequência aleatória e descontrolada, e o último leva a outros problemas, incluindo a dificuldade para a superexpressão de proteínas tóxicas e de grande porte e a purificação de proteínas complexas com cofator e outras enzimas delicadas.

Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos um método enzimático que conjuga monomer proteático em conjunto para polímero/poliproteína de forma stepwise usando uma proteína ligase OaAEP1 combinada com um TEV 8^protease,9. OaAEP1 é uma endopeptidase rigorosa e eficiente. Duas proteínas podem ser ligadas covalentemente como sequência Asn-Gly-Leu (NGL) através de dois termini por OaAEP1 em menos de 30 min se o N-terminus for resíduos Gly-Leu (GL) e a outra do qual o terminal C é resíduos NGL¹⁰. No entanto, o uso do OaAEP1 apenas para ligar o monômero de proteína leva a um polímero proteico com uma sequência descontrolada como o método de acoplamento à base de cisteína. Portanto, projetamos o N-terminus da unidade proteica com um local protease TEV removível mais um resíduo de leucina como ENLYFQ/G-L-POI. Antes do decote TEV, o n-terminal não participaria da ligadura OaAEP1. E então os resíduos GL no N-terminus, que são compatíveis com a ligadura OaAEP1, são expostos após o decote TEV. Assim, alcançamos um método sequencial de biosíntese enzimática de poliproteína com uma sequência relativamente bem controlada.

Aqui, nosso método de síntese enzimática stepwise pode ser usado na preparação de amostras de poliproteína, incluindo controlado por sequência e descontrolado, e imobilização proteica para estudos de moléculaúnica também, especialmente para o sistema complexo, como metaloproteína.

Além disso, os experimentos de SMFS baseados em AFM nos permitem confirmar a construção e estabilidade do polímero de proteína no nível de uma única molécula. A espectroscopia de força de molécula única, incluindo AFM, pinça óptica e pinça magnética, é uma ferramenta geral na nanotecnologia para manipular a biomolécula mecanicamente e medir sua estabilidade^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20}. A AFM de molécula única tem sido amplamente utilizada no estudo da proteína (un)dobrável^{21,22,23,24,25}, a medida de força do receptor-ligand interação^{26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35}, ligação química inorgânica^{20,36,37,38,39,40,41,}42^,43e metal-ligand vínculo em metaloproteína^{44,45,46,47,48,49, 50} . Aqui, a AFM de uma única molécula é usada para verificar a sequência de poliproteína sintetizada com base no sinal de desdobramento da proteína correspondente.